Патологическая анатомия / Педиатрия / Патологическая физиология / Оториноларингология / Организация системы здравоохранения / Онкология / Неврология и нейрохирургия / Наследственные, генные болезни / Кожные и венерические болезни / История медицины / Инфекционные заболевания / Иммунология и аллергология / Гематология / Валеология / Интенсивная терапия, анестезиология и реанимация, первая помощь / Гигиена и санэпидконтроль / Кардиология / Ветеринария / Вирусология / Внутренние болезни / Акушерство и гинекология Медицинска паразитология / Патологична анатомия / Педиатрия / Патологична физиология / Оториноларингология / Организация на здравна система / Онкология / Неврология и неврохирургия / Наследствени, генетични заболявания / Кожни и полово предавани болести / Медицинска история / Инфекциозни заболявания / Имунология и алергология / Хематология / Валеология / Интензивно лечение, анестезиология и интензивни грижи, първа помощ / Хигиена и санитарен и епидемиологичен контрол / Кардиология / Ветеринарна медицина / Вирусология / Вътрешна медицина / Акушерство и гинекология
основен
За проекта
Медицински новини
За автори
Лицензирани книги по медицина
<< Предишна Следващ >>

Качествени и количествени методи за определяне на IgA, IgG и IgM.

Имуноглобулините са гликопротеини, секретирани от плазмените клетки. Производството на антитела обикновено става след антигенна стимулация. Повечето антигени предизвикват едновременно стимулиране на няколко клона на В-лимфоцити - поликлонална стимулация. Антителата, получени от един клон от В-лимфоцити, моноклонални антитела, са напълно идентични. Винаги има разлики между антитела, произведени от различни клонинги на В-лимфоцити, например, в структурата на мястото на свързване с антигена или силата на свързване с антигена. Известни са пет класа имуноглобулини: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. Структурата на имуноглобулинова молекула от всеки клас се основава на Y-образна структура, състояща се от 2 тежки и 2 леки вериги, свързани чрез дисулфидни мостове (вж. Гл. 1, стр. IV.A.4). "Клоните" на молекулата (Fab фрагмент) служат за свързване на антигена, а "багажникът" (Fc фрагмент) изпълнява други биологични функции: активира комплемента, свързва се с клетъчната мембрана и др. IgG присъства в биологични течности под формата на мономери. Те съставляват по-голямата част от серумните имуноглобулини и са основният клас имуноглобулини, произведени при вторичния имунен отговор. IgEs, също мономерни, участват в незабавни алергични реакции. IgD са разположени главно върху мембраните на В-лимфоцитите и играят ролята на антиген-разпознаващи рецептори; в серума те присъстват в незначително количество под формата на мономери. IgA се намира в серума главно под формата на мономери, в секрецията на лигавиците и в коластрата - под формата на димери, които съдържат и J верига и секреторен компонент, който се синтезира в епитела на лигавиците. Димерният IgA се свързва с секреторния компонент, преминавайки през епитела към повърхността на лигавицата. IgM присъстват в серума главно под формата на пентамери. Те съставляват по-голямата част от имуноглобулините, произведени по време на първичния имунен отговор. Методите за изследване на имуноглобулини включват определяне на нивото на имуноглобулини от различни класове и подкласове и антитела към специфични антигени. Когато се оценяват резултатите от проучването, е необходимо да се вземе предвид, че нивото на имуноглобулините зависи от възрастта (виж приложения IV и V). Промяната в нивото на имуноглобулините в серума може да е резултат от нарушение на техния синтез, катаболизъм или екскреция.

А. Електрофореза

1. Зоновата електрофореза е полуколичествен метод, който ви позволява да отделите смес от протеини в зависимост от тяхното молекулно тегло и електрически заряд. Същността на метода е следната: тестовата протеинова смес върху носител (например плоча с гел) се поставя в камера за електрофореза, пълна с буферен разтвор и свързана към източник на постоянен ток. Когато електрофорезата на серумните протеини обикновено се получава 5 основни ленти, които съответстват на фракциите на албумин, алфа1-, алфа2-, бета- и гама-глобулини (виж фиг. 20.1). Имуноглобулините мигрират главно към фракцията на гама глобулин, въпреки че те също присъстват в бета и алфа2 глобулиновите фракции. Относителното съдържание на всяка фракция на суроватъчните протеини може да се оцени с помощта на денситометър. Използвайки зонална електрофореза, можете да изследвате не само серума, но и други биологични течности, като CSF и урина. Този метод ви позволява да оцените протеиновия състав на тестовата проба и да идентифицирате моноклонални антитела, въпреки че не е достатъчно чувствителен за определяне на моноклонални антитела в ниски концентрации в ранните етапи на миелома.

2. Имуноелектрофореза. Същността на метода е следната: 1) провеждане на електрофоретично разделяне на протеини в гел; 2) в края на гел-електрофорезата жлебовете се изрязват успоредно на посоката на електрофорезата; 3) антитела (антисерум) се въвеждат в жлебовете, например, в тежки (алфа, делта, епсилон, гама, мю) или леки (ламбда, капа) вериги на имуноглобулини. Тези антитела и разделени с електрофореза протеини дифундират един към друг. В тези места, където антителата се свързват с протеини, се образуват дъги за утаяване (виж фиг. 20.2). Имуноелектрофорезата ви позволява да оцените само качествения състав на изследваната протеинова смес. Оценката на резултатите от изследването изисква висока квалификация. Най-често този метод се използва за идентифициране и характеризиране на моноклонални антитела.

3. Електрофореза с имунофиксация. Този метод се основава на електрофоретичното разделяне на серумните протеини в гел, последвано от инкубация на гела в присъствието на антитела към тежките и леки вериги на имуноглобулини. Когато протеините се свързват с антитела, се образуват имунни комплекси, които могат да се видят след оцветяване (вж. Фиг. 20.3). Имунните комплекси, съдържащи нормални имуноглобулини, се отлагат под формата на широка, замъглена лента, моноклонални - под формата на по-тясна и ясно дефинирана. Този метод също е висококачествен, но по-чувствителен и прост от имуноелектрофорезата. Имунофиксиращата електрофореза често се използва в комбинация с имуноелектрофореза за определяне на моноклонални или олигоклонални имуноглобулини.

Б. Двойната радиална имунодифузия е полуколичествен метод, с който можете не само да идентифицирате антигените, но и да оцените степента на сходство между тях. Същността на метода е следната: 1) тестовата смес от антигени и антитела с известна специфичност се въвежда в дупките, изрязани в агар (обикновено антителата се въвеждат в централната дупка и антигените, разположени около нея); 2) антигените и антителата дифундират един към друг; 3) на мястото, където е станало свързването на антитела и антигени, се образуват ленти за утаяване. Чрез взаимното подреждане и формата на лентите за утаяване може да се оцени степента на сходство между антигените, разположени в съседни ямки. Понастоящем този метод се използва при диагностицирането на автоимунни заболявания за откриване на автоантитела срещу извлечени ядрени антигени (виж гл. 15, стр. II.E.2). Въпреки че методът на двойна радиална имунодифузия е по-нисък по чувствителност към много количествени методи, той е технически прост, не изисква силно пречистени антитела, специфичен е и може да се използва в масови изследвания.

Б. Простата радиална имунодифузия ви позволява да определите количествено съдържанието на антиген в тестовата проба. Същността на метода е следната. Ямките са изрязани в слой от агар, съдържащ антитела, в някои от които се въвежда тестовият антиген, в други - стандартен. Антигените дифундират от ямките до агар, образувайки радиални зони за утаяване. Диаметърът на зоната за утаяване е пропорционален на концентрацията на антиген. Това е прост и надежден метод за количествено определяне на имуноглобулини (включително IgG подкласове), компоненти на комплемента (например C3, C4, фактор В) и други серумни протеини. Има готови комплекти, които ви позволяват да определите антигена в ниска концентрация - не повече от 3 μg / ml.
При определяне на съдържанието на имуноглобулини трябва да се има предвид, че промяна в техните свойства може да изкриви резултатите от изследването. Така че, ако серумът съдържа мономерни IgM (например с Waldenstrom макроглобулинемия, атаксия-телеангиектазия), нивото на IgM ще бъде изкуствено високо, тъй като мономерният IgM се дифундира по-бързо от пентамерния IgM. Напротив, наличието на ревматоиден фактор в тестовата проба изкуствено намалява нивото на IgG, тъй като имунните комплекси, състоящи се от IgG и ревматоиден фактор, дифундират по-бавно от необвързания IgG. Серумът на много пациенти с дефицит на IgA съдържа антитела срещу протеини от животински произход, например, към кози имуноглобулини, така че при използване на кози антитела за определяне на нивото на IgA в този случай се получават надценени резултати.

Г. Нефелометрия - определяне на концентрацията на суспендирани частици и макромолекулни вещества в разтвор на базата на оценка на интензивността на разсейване на светлината, преминаваща през този разтвор. Нефелометрията може да се използва за определяне на концентрацията на антигени, тъй като когато към тях се добавят антитела, се образуват имунни комплекси, които разпръскват предаваната светлина. Нефелометрията позволява да се определи с висока точност концентрацията на IgG, IgA, IgM, подкласове на IgG, С3, С4, фактор В, С-реактивен протеин и някои други суроватъчни протеини. Този метод е подходящ за определяне на протеини в ниски концентрации, като IgE, чието ниво на серум не надвишава 1 µg / ml. Понастоящем много лаборатории използват нефелометрията като стандартен метод за количествено определяне на имуноглобулините.

Г. RIA. Този силно чувствителен метод е разработен преди повече от 30 години и за първи път е използван за определяне на концентрацията на инсулин и други хормони. Сега се използва за определяне на антигени и антитела. Има няколко модификации на метода. Една от тях се основава на конкурентното свързване на радиоактивно белязан и белязан антиген с антитела. Същността на метода е следната: 1) известно количество антитяло се смесва с известно количество белязан антиген и тестова проба (съдържаща неизвестно количество антиген); 2) съдържащият се в пробата антиген и стандартният белязан антиген се свързва с антитела; 3) колкото по-високо е съдържанието на белязан антиген, толкова по-слабо белязан антиген ще се свърже с антитела (виж фиг. 20.4). Концентрацията на антиген в тестовата проба се оценява чрез нивото на радиоактивност на имунните комплекси. Същият подход може да се използва за определяне на концентрацията на антитела в пробата. В този случай известно количество антиген се смесва с известно количество стандартно белязани антитела и тестова проба (съдържаща неизвестно количество антитела). Друга модификация на метода се основава на обездвижването на антиген или антитяло върху твърда подложка (виж глава 20, стр. I.E). Основните недостатъци на метода са необходимостта от скъпо оборудване и реактиви, както и условията за работа с радиоактивни изотопи.

Д. Твърдофазна ELISA. Като твърда фаза най-често се използват полистиролни таблетки с антигени или антитела, адсорбирани върху тях. Определянето на антитела към всеки антиген се извършва по следния начин: 1) тестваната течност се въвежда в ямките на плаката с антиген, адсорбиран върху тях; 2) по време на инкубацията антителата се свързват с антигена; 3) плаката се промива от несвързани антитела и се добавят антитела към имуноглобулини (втори антитела), белязани с ензима; 4) таблетката се промива отново, добавят се ензимният субстрат и хромогенът (вещество, което променя цвета си по време на химическата реакция); 5) под въздействието на продукта на ензимната реакция, хромогенът променя цвета си. Колкото повече белязани с ензим втори антитела се свързват с комплекси антиген - антитела, толкова по-висока е активността на ензима и интензивността на цвета на разтвора (вж. Фиг. 20.5). Концентрацията на антитела в пробата се определя спектрофотометрично - от оптичната плътност на оцветен разтвор. Същият подход се използва за определяне на антигена в пробата. В този случай се използват таблетки с адсорбирани антитела към тестовия антиген, като вторите антитела, белязани с ензима, също са насочени към този антиген (вж. Фиг. 20.5). Твърдофазната ELISA се използва за количествено определяне на антитела и антигени. По отношение на чувствителността е сравнима с RIA, но е по-проста, по-евтина и не изисква използването на радиоактивни изотопи. Много лаборатории използват твърдофазна ELISA като стандартен метод за определяне на антивирусни антитела, включително антитела срещу HIV, цитокини и имуноглобулини (подкласове IgE и IgG).

G. Imunoblotting е висококачествен метод за откриване на антигени и антитела в тестова проба. Антителата, използващи този метод, се откриват, както следва: 1) смес от известни антигени се отделя чрез електрофореза на полиакриламиден гел и се прехвърля в нитроцелулозна мембрана; 2) мембраната се инкубира с тестовата проба, например серум и след това с белязани антитела срещу имуноглобулини. За откриване на антигени протеините от тестовата проба се подлагат на електрофоретично разделяне, които след това се прехвърлят в мембраната, последвано от добавяне на белязани антитела към известни антигени. Понастоящем се предлагат готови комплекти за имуноблотинг. Този метод се използва широко за потвърждаване на резултатите от ELISA в твърда фаза при диагностициране на HIV инфекция.

З. Други методи на изследване

1. Индиректната имунофлуоресценция е метод, чрез който могат да бъдат открити антитела към известни антигени. Тъканните участъци или клетъчните култури обикновено се използват като източник на антиген. Субстратът, пренесен върху стъклен предмет, се инкубира в присъствието на тестова проба, например, серум и след това в присъствието на флуорохром маркирани антитела срещу имуноглобулини. Антитела, свързани към субстрата, се откриват с помощта на флуоресцентен микроскоп. Този метод обикновено се използва за откриване на антинуклеарни антитела и антитела към определени вируси. Въпреки че методът не е количествен, той е доста чувствителен и прост.

2. Методи, основани на реакция на аглутинация. За реакцията на аглутинация обикновено се използват червени кръвни клетки (хемаглутинация) или частици от латекс (латексна аглутинация), покрити с известен антиген. В присъствието на антитела към този антиген се случва аглутинация на червени кръвни клетки или латексни частици. Хемаглутинацията се използва за откриване на антитела към тиреоглобулин и микрозомални антигени, латексна аглутинация за откриване на ревматоиден фактор и някои други антитела. Тези методи са прости и ви позволяват да определите количествено антигена, но са по-малко чувствителни от RIA и твърдофазна ELISA.
<< Предишна Следващ >>
= Преминете към съдържанието на учебника =

Качествени и количествени методи за определяне на IgA, IgG и IgM.

  1. Методи за определяне на количествените и качествени характеристики на емисиите и емисиите на замърсители в атмосферата
    1. За определяне на количествените и качествени характеристики на емисиите и замърсителите в атмосферата се използват инструментални и изчислителни (изчислителни и аналитични) методи. Инструменталните методи преобладават за източници с организирано изпускане на замърсители в атмосферата (GOST 17.2.3.02-78). Основните източници с организирано пускане включват: - димоотвод и
  2. Определяне на количествените и качествени характеристики на източниците на замърсяване на въздуха
    1.4.1. Определяне на единична стойност на емисионната мощност (g / s) 1. При определяне на параметрите на източниците на атмосферно замърсяване (ISA) трябва да се вземе предвид продължителността на излъчването на замърсители. При изчисляване на повърхностни концентрации на замърсители, използващи нормативната методология за изчисляване на OND-86 [6], трябва да се използват емисиите на замърсители в атмосферата. M (g / s), присвоено на 20 минути
  3. Методи за качествена оценка и количествено измерване на личностното и професионално развитие
    Методи за качествена оценка и количествено измерване на лично и професионално
  4. Методи за качествена оценка и количествено измерване на личностното и професионално развитие
    Методи за качествена оценка и количествено измерване на лично и професионално
  5. Определяне на количествения и качествен състав на емисиите на замърсители във въздуха от основните технологични процеси.
    Определяне на количествения и качествен състав на емисиите на замърсители в атмосферата от основните технологии
  6. Качествени или количествени?
    Лошо, добро, зло - можем да оценим всеки обект по качество. Как изглежда той? Какви чувства предизвиква? Как изглежда? Какво прави? Всичко това са качествени въпроси. Въпреки че тези атрибути не могат да бъдат измерени или преброени, те са тези, които изчерпателно разграничават един обект от друг *. Както видяхме вчера, когато говорим за портрети, висококачествените снимки ни предоставят редица визуални
  7. Количествени и качествени измервания
    Качествената оценка и количественото измерване в психологическите изследвания и практическите приложения от официална гледна точка могат да се разглеждат като специални случаи на по-обща процедура за измерване. В първо приближение приписването на числови стойности за представяне на свойства може да се нарече измерение. В резултат на измерването във всеки случай се свързва измереното свойство
  8. Количествени и качествени измервания
    Качествената оценка и количественото измерване в психологическите изследвания и практическите приложения от официална гледна точка могат да се разглеждат като специални случаи на по-обща процедура за измерване. В първо приближение приписването на числови стойности за представяне на свойства може да се нарече измерение. В резултат на измерването във всеки случай се свързва измереното свойство
  9. Качествена и количествена оценка на психичното развитие на децата
    Качествена и количествена оценка на психичното развитие на децата Нормално разпределение на децата в групи Гранично състояние I група II група III група IV група 1. Деца с напредващо развитие: а) 2 епикризисни периода (високо развитие); б) 1 период на епикриза (ускорено развитие) , Дети с задержкой развития на1 эпикризный срок:а) 1 степень - задержка 1- 2 показателей;б) 2 степень -
  10. Количественный и качественный состав выбросов загрязняющих веществ в атмосферный воздух от основных технологических процессов.
    Количественный и качественный состав выбросов загрязняющих веществ в атмосферный воздух от основных технологических
  11. Определение сероводорода (качественная реакция)
    Метод основан на взаимодействии сероводорода, образующегося при порче рыбы, со свинцовой солью с появлением темного окрашивания. 15...25 г исследуемого фарша помещают рыхлым слоем в бюксу вместимостью 40...50 см3. В бюксу подвешивают горизонтально над фаршем полоску плотной фильтровальной бумаги, на поверхность которой, обращенной к фаршу, нанесены 3...4 капли раствора свинцовой соли. диаметър
  12. Определение аммиака (качественная реакция)
    Метод основан на взаимодействии аммиака, образующегося при порче рыбы, с соляной кислотой и появлении при этом облачка хлористого аммония. В широкую пробирку наливают 2...3 см3 реактива Эбера (смесь одной части соляной кислоты, трех частей этилового спирта и одной части серного эфира), закрывают пробкой и встряхивают два-три раза. Вынимают пробку из пробирки и сразу же закрывают ее другой
  13. Качественные методы оценки
    К настоящему времени в отечественной и мировой практике разработано значительное число систем оценки управленческого персонала, которые можно классифицировать по различным основаниям. Решение вопроса о содержании (или предмете) оценки является одним из исходных при формировании любой системы. Анализ того, что является содержанием оценки, - а именно: какие стороны управленческой деятельности
  14. Количественные методы оценки форменных элементов в моче
    Унифицированный метод определения количества форменных элементов в 1 мл мочи методом Нечипоренко Принцип метода Определение количества эритроцитов, лейкоцитов, цилиндров в 1 мл в счетной камере. Ход определения 10 мл свежесобранной утренней мочи, взятой в середине мочеиспускания и имеющей слабокислую реакцию (в моче со щелочной реакцией может быть частичный распад клеточных элементов),
  15. Методы количественной оценки форменных элементов в моче и их морфологические особенности.
    В целях диагностики скрыто протекающих латентных форм воспалительных заболеваний почек и мочевых путей, когда отсутствуют или лишь незначительно выражены клинические и лабораторные признаки, в нефрологической практике широко пользуются методами количественного подсчета эритроцитов, лейкоцитов и цилиндров в суточном объеме мочи (метод Каковского-Аддиса), в 1 мл мочи (по Нечипоренко) и за 1 мин (по
  16. Изучение гендерной идентичности при помощи качественных методов: фокус=группа
    Изучение гендерной идентичности при помощи качественных методов:
  17. Количественные методы оценки : Экспертные оценки
    Количественные оценки, например деловых и организаторских качеств работника, производятся, как правило, с помощью экспертных оценок. При этом для характеристики кандидата на должность сначала устанавливают (с учетом специфики производства и условий работы) 6-7 критериев. Например: 1. способность организовывать и планировать труд; 2. профессиональная компетентность; 3. сознание
Медицински портал "MedguideBook" © 2014-2019
info@medicine-guidebook.com