Патологическая анатомия / Педиатрия / Патологическая физиология / Оториноларингология / Организация системы здравоохранения / Онкология / Неврология и нейрохирургия / Наследственные, генные болезни / Кожные и венерические болезни / История медицины / Инфекционные заболевания / Иммунология и аллергология / Гематология / Валеология / Интенсивная терапия, анестезиология и реанимация, первая помощь / Гигиена и санэпидконтроль / Кардиология / Ветеринария / Вирусология / Внутренние болезни / Акушерство и гинекология Медицинска паразитология / Патологична анатомия / Педиатрия / Патологична физиология / Оториноларингология / Организация на здравна система / Онкология / Неврология и неврохирургия / Наследствени, генетични заболявания / Кожни и полово предавани болести / Медицинска история / Инфекциозни заболявания / Имунология и алергология / Хематология / Валеология / Интензивно лечение, анестезиология и интензивни грижи, първа помощ / Хигиена и санитарен и епидемиологичен контрол / Кардиология / Ветеринарна медицина / Вирология / Вътрешна медицина / Акушерство и гинекология
основен
За проекта
Медицински новини
За автори
Лицензирани книги по медицина
<< Предишна Следващ >>

Отглеждането на човешки грипни вируси в лабораторията, кръга на домакините сред лабораторните животни и изолирането на вируса от клиничния материал

B.R.DAUDLE и G.S. SCHILD (WR DOWDLE, G. C. SCHILD)



I. ВЪВЕДЕНИЕ

За първи път преминаването на вируса на грипа в експеримента е извършено в началото на века при работа с HPV, но до 1955 г. той не се приписва на грипни вируси (Schafer, 1955). През 1931 г. Шоп пасира „класически“ свински грип, като интраназално прилага филтрат от дихателни секрети. Първите данни за инфекцията на лабораторни животни с вируса на човешкия грип са получени от Smith et al. (1933). Авторите показаха, че поровете, заразени с секрети от дихателните пътища на човек с грип, развиха респираторна инфекция, придружена от треска и се разпространява естествено сред тях. Тези резултати са потвърдени скоро от Франсис (1934). След това беше показано, че при мишки, инжектирани с йоден анестетизиран материал, взет от турбината на болни порове, се разви пневмония (Andrewes et al., 1934). Тези изследвания доведоха до използването на лабораторни животни за определяне на инфекциозността на вируса и осигуриха бързо натрупване на знания за свойствата на грипните вируси и имунитета към тази инфекция.

Бърнет (1940) откри, че грипният вирус може да се размножава в „микробите, които линиират алантоичната и околоплодната кухини на пилешкия ембрион, което беше важно за изследването на грипните вируси. Имаше възможност да се избегнат неудобствата, свързани с работата върху лабораторни животни, както и възможността да се получи грипният вирус в големи количества под формата на алантоидна течност от заразени ембриони. В допълнение, стана „възможно директно да се изолира грипният вирус“ в ембриони, без първо да се адаптира към порове или мишки, което може да доведе до случайно заразяване на вируса от външни агенти. Откриването на хемаглутиниращите свойства на вирусни частици (Hirst, 1941) също беше от голямо значение, тъй като даде възможност за откриване на вируса, без да е необходимо да се демонстрират неговите инфекциозни свойства. Следващата стъпка, която имаше очевидно значение за изучаването на репликацията на грипния вирус, беше култивирането на вируса в клетъчните култури (Mogabgab et al., 1954). Развитието на плакови системи в еднослойни клетъчни култури за определяне на вируса на инфекциозния ™ в крайна сметка дава възможност да се получат чисти клонинги на грипния вирус за генетични експерименти.

II. КУЛТИВИРАНЕ НА ВИРУСИ В ЛАБОРАТОРНИ УСЛОВИЯ

А. КУЛТУРИ НА КЛЕТКИ

Въвеждане на вируси на грип А или В в (Клетъчната култура причинява един от трите ефекта: 1) вирусът се размножава с различна ефективност, образувайки инфекциозно потомство (продуктивна инфекция); 2) вирусът преминава през непълен репродуктивен цикъл с образуването на непълен (вирус на повърхността на клетките или неинфекциозни вирусни частици в средата (абортивна инфекция); 3) вирусът не успява да зарази филма. Някои експериментални данни (предполагат, че е възможно да се установи състоянието на хронична инфекция, при която (малки количества от инфекциозния вирус се отделят в средата за дълго време (персистираща инфекция).

1. Продуктивна инфекция

Репликативният цикъл на грипните вируси е описан подробно.

в гл. 8. След въвеждането на вируса <в 'културата на чувствителни лепила

ток следва период на "затъмнение" ^ траещ ок

приблизително 2 часа, през които не

или „биологични или серологични прояви на синтез

вирусни протеини. През този период, синтеза на вируса

специфични йолипептиди, включително специфични за вируса

окси 'компоненти, които не са включени във вириона.

Около 2 часа след заразяване в клетките,

откриват нуклеотидния антиген (NP). Количество от това

компонент достига максимум до 5-6-ия час след зазоряване

zheniya. Наличието на хемаглутинин или повърхностен ан

тигри в клетъчни екстракти се откриват 3 часа след

инфекция. Вирусът на пъпката може да бъде открит на

клетъчните мембрани приблизително 5 '/ g h след разсъмване

zheniya. Малко след това, около 6 часа след зазоряване

zheniya, вирусът започва да навлиза в околната среда, и инфекциозен

вирусът 'достига максималната си концентрация в средата

7-8 часа след заразяване

Когато сме заразени с (човешки грипен вирус на различни първични) култури от клетки, получени от тъканите на птици или бозайници в тях (има продуктивен цикъл. Списък на тези култури може да бъде намерен в Hoyle (1968). За да не се повтаря този списък, ще се опитаме да обобщим този списък) най-значимите постижения, постигнати от редица изследователи през повече от 20 години експериментална работа.

Епителиоидните клетки са най-чувствителната система за култивиране in vitro на широк спектър от грипни вируси на грип А и В. Най-често се използват за тези цели, бъбречни човешки фетали (Mogabgab et al., 1954), резус маймуни или зелени маймуни (Mogabgab et al., 1961 г.), бъбреци на телета (Haas, Wulff, 1957; Lehmann-Grube, 1965), свине. (Lehmann-Grube, 1964), както и хамстери (Heath, Tyrrell, 1959). От тях по-често се използват първични клетки на бъбреците, маймуните, хората и телетата. Обикновено предпочитат маймунски бъбреци, поради скоростта на растеж и удобството. циркулация.

Не всички култури от елилоидни клетки са разрешителни за вируса (грип. Първичните диплоидни и хетероплоидни клетки на човешкия амнион, както и други (хетероплоидните епителни клетки) обикновено са нечувствителни към него. Такива линии включват yasak HeLa, KB, конюнктивални клетки (Green et al., 1957), както и МАГ и човешки сърдечни и чревни клетки (Wong, Kilbour-ne, 1961).

Културите на епителни клетки, получени от органи, имат по-равномерна чувствителност към грипни вируси в сравнение с културите, получени от органи на ембриона. Според нашите данни, клетъчните култури, приготвени от бъбреците мъртвородени (Бебетата са толкова чувствителни към грипни вируси, колкото и маймунските култури на бъбречните клетки, а човешките ембрионални култури на бъбречни клетки са по-малко чувствителни. Значителен проблем при използване на човешки ембрионални бъбреци е разликата в чувствителността между различните бъбреците обикновено се получават от ембриони от различни възрасти, условията за тяхното производство също варират, което води до силен (колебателен процент на жизнеспособни клетки. Тези фактори Те водят до голямо разнообразие в съотношението между епителиоидните и фибробластоидните клетки в културите на ембриона и човешките бъбреци, което от своя страна може да доведе до значителни изменения в чувствителността към вируса. Епителиоидните клетки, за разлика от фибробластоидните клетки, поддържат репликацията на вируса. по отношение на клетките на бъбреците от свински култури, култури, получени от бъбреци на възрастни свине, се състоят главно от епителиоидни клетки, които поддържат репликацията на грипния вирус. Културите, получени от ембрионални бъбреци, са почти изцяло представени от фибробласти и са практически нечувствителни към вируса (Lehmann-Grube, 1964). Този модел е валиден за много видове.

Чувствителността на епителиоидните клетки към грипната инфекция намалява с субкултурата. В някои случаи, например, когато използвате „пръста на бъбрека на човешки ембрион, подпараза насърчава разпространението на фибробласти, които са нечувствителни към вируса. В други случаи, например, когато използват маймунски бъбреци (Dowdle, непубликувани данни) и телета (Lehmann-Grube, 1964), клетъчните култури запазват епителиоидните си свойства по време на многобройни пасажи, но чувствителността им към вирусите се променя още по време на първата субкултура. Диплоидия на епителиоидните клетки (клетките сами все още не определят чувствителността към вируси.

Някои вируси могат да се размножават или придобиват способността да се размножават след адаптация във фибробласти или в хетероплоидни клетъчни линии, но има малко такива щамове. NWS щамът на грипния вирус A (iHONl) е уникален в широчината на клетъчния спектър; може да се размножава в хетероплоидни епителни клетки (Wong, Kilbourne, 1961), във фибробласти (Kilbourne et al., 1964) и IB MDBK, хетероблоидна бъбречна клетъчна линия на говедата (Choppin, 1969). Вирусът на грип В също е в състояние да се размножава в хетероплоидната линия, получена от бъбреците на кучетата (Green, 1962).

Специфичността по отношение на приемната клетка не винаги може да бъде предвидена. Вирусите от свински грип не се разпространяват в човешките бъбречни клетъчни култури (Hinz и Syverton, 1959), но вирусите на човешкия грип се размножават добре в бъбречните клетки на свинете (Lehmann-Grube, 1964). Клетъчната култура на маймуните в бъбреците е нечувствителна към грипни вируси по конете (Heq2Neq2), когато се заразява директно с клиничен материал, но същите вируси се размножават в маймунски бъбречни клетки след един пасаж върху пилешки ембриони (Dowdle et al., 1963).

Недостатъчно пълното елиминиране на серумните компоненти преди инокулирането на вируса е една от основните причини за изолирането на вируса в малък процент от случаите и за получаване на ниски инфекциозни титри в чувствителни клетъчни култури. Серумните компоненти, които са необходим компонент на средата за растежа на клетките, могат да неутрализират специфично вируса. Това е най-голямото

степента се отнася до вируси, изолирани след 1957 г. Инхибиторният ефект на серума може да бъде елиминиран чрез двойно или многократно промиване на клетки със среда без серум.

2. Абортивна инфекция

Henle et al. (1955 г.) са първите, които показват, че клетките на HeLa (от карцином на шийката на човека), заразени с голямо множество от вируса, разпространен върху пилешки ембриони, произвеждат неинфекциозни хемаглутиниращи частици. Абортната инфекция се наблюдава и при L клетки, заразени с FPV (Franklin, Breitenfeld, 1959), както и в различни клетъчни линии, заразени с вирус на свински грип (Wong, Kilbourne, 1961), Krebs-2 оцетни туморни клетки (Low et al:, 1962), в клетки BHK-21 (Fra-ser, 1967) и в BSC-1 клетки (Nikitin et al., 1972). Абортната инфекция се наблюдава не само в хетероплоидни клетки, но и при човешки диплоидни фибробласти (Kilbourne et al., 1964).

Механизмът на заразяване с аборти не е напълно ясен; вероятно някой етап от цикъла на възпроизвеждане на вируса е блокиран. В експериментите върху изследването на непълни репродуктивни цикли на грипния вирус в клетките на HeLa (Henle et al., 1955) или в L клетки (Franklin, Breitenfeld, 1959) се забелязва образуването на значително количество както NP антиген, така и хемаглутиниращи частици. Loffer et al. (1962) показа, че при абортивна инфекция в клетките на HeLa, NP се натрупва в ядрото, а освободените вирусни частици не съдържат пълната последователност на вирусни РНК нуклеотиди. Choppin and Pons (1970) установяват, че най-големият от 'вирусни РНК фрагменти липсва в тези хемаглутиниращи неинфекциозни частици, но има увеличен брой малки фрагменти от РНК.Тези автори откриват също, че клетките на HeLa могат да произвеждат инфекциозен вирус, ако няма инокулум непълен вирус. В тази връзка абортивната инфекция в клетките на HeLa е подобна на класическите феномени на фон-Mairayea, т.е. производството на непълен вирус в пилешки ембриони.

3. Устойчива инфекция

Редица експериментални данни предполагат възможността за хронична инфекция, придружена от ниска продукция на вируса, причинена от грипни вируси в тъканите. Tyrrell (1959) описва хронична инфекция на бъбречната култура на телетата с вируса на WS. Гаврилов и др. (1972 г.) установяват, че три страсти на женските бъбреци

заразена с вируса WSN, вирусът може да бъде открит за 105 дни. Уилисън и Барланд (1972) показват устойчивостта на вируса P.JR8 в продължение на 50 дни след заразяване с културата на белия дроб на човешкия дроб. В културата цитиоидният ефект не се разви и в течността на културата бяха открити малки количества от инфекциозния вирус. Такива доклади показват, че поне някои щамове на грипния вирус могат да причинят развитието на краткотрайна хронична инфекция, но все още не е доказана „истинска“ персистираща инфекция с грипния вирус.

4. Параметри на инфекция

а) Вирус-специфични компоненти в клетката. Методът на флуоресцентни антитела (FA), предложен от Weller and Coons (1954), се използва широко като имунологичен тест за „идентифициране и локализиране на вирусоспецифични антигени в заразените“ клетки. Преките и индиректните методи на имунофлуоресценция, прилагани към вируси, са описани подробно в преглед на Liu (1969). По-рано от други, този метод е приложен към грипния вирус Watson <and Coons (1954), както и Liu (1955), който показва предимно ядрена локализация на флуоресценцията поради NP антиген в клетки, заразени с грипния вирус. Впоследствие този метод се използва широко за изследване на разпределението на антигените на грипния вирус в различни периоди от цикъла на репродукция на вируса. Maepo и Kilbourne (1970) описват разпределението на NP, хемаглутинин и невраминидаза. Oxford and Schild (1974) изучават разпределението на всички четири основни вирусни антигена, включително М протеин.

Опитите за титриране на грипния вирус в клетъчната култура, използвайки техниката на флуоресцентни антитела, са направени от Oxford and Schild (1968), които описват техниката за „преброяване на инфекциозни центрове за оценка на броя на флуоресцентните клетки“.

Dimmock (1969) откри наличие на вирус-специфичен антиген в ядрата на клетките, заразени с грипния вирус. Антигенът може да бъде открит с помощта на метода FA с помощта на серуми на заразени мишки, но не-серуми, приготвени срещу вирусни частици. Флуоресценцията в ядрата се появи в ранните етапи на инфекцията и според автора се дължи на вирусен антиген, който се натрупва в заразените клетки, но не включени във вирусни частици.

Методът на ФА е много чувствителен.

малки количества антиген или антитела, но това може да произведе

неспецифично оцветяване, следователно, контролна подготовка

Оценките са строго задължителни. За да откриете някои:

антигени, е необходимо да се използват високо специфични антисеруми, получени чрез имунизация с пречистени антигени.

Техниката за радиоактивни етикети се използва широко за откриване на вътреклетъчни вирусни протеини при възпроизвеждането на грипния вирус. Becht (1969) използва етикета с радиоактивни прекурсори и авторадиография, за да покаже предимно ядрена локализация на NP. Други автори (Joss et al., 1969; Taylor et al., 1969; Ske-hel, 1972) използват радиоактивен етикет и PAAGE. Тези изследвания ще бъдат описани подробно по-долу и тук те ще бъдат само споменати. Един от най-ефективните методи беше използването на 358-метионин, който ефективно се включва във вирусните протеини. Skehel (1972), използвайки този метод, откри синтеза на 9 полипептиди в клетки, заразени с грипния вирус. Седем от тях съответстват на известни структурни полипептиди на вируса. Два полипептида (8 и 9) не могат да бъдат идентифицирани със структурните компоненти на вируса; те се считат за кодирани с вируси продукти, които не са включени във вирусни частици. Тези компоненти се откриват малко след заразяването (Skehel, 1973), но значението им за инфекциозния процес е неизвестно.

Методи като имуноферритивно маркиране, последвано от електронна микроскопия, не дават значителни резултати при опит за идентифициране на вътреклетъчни антигени в клетки, заразени с грипния вирус. Една от основните пречки тук беше неспецифичното свързване на имуноферритин с кленови протеини. Тези методи обаче успешно се използват за идентифициране на вирусни антигени на клетъчната повърхност.

б) Вирусни компоненти на повърхността на клетката. Техниката на хемадсорбция (Had), предложена от Вогел и Шелоков (1957), е чувствителна към откриването на хемаглутинин на повърхността на заразена клетка. С този метод морски свинчета, пилета или човешки еритроцити се въвеждат в заразена клетъчна култура, която след това се промива и инкубира в среда без серум. Присъствието на вируса се определя от наличието на групи от червени кръвни клетки, свързани на повърхността на клетъчния слой. Трябва да се използват червени кръвни клетки, които са аглутинирани от този вирус. Най-широко използваното за (хеми-адсорбция беше бъбречната култура от маймуни и телета. Културната култура на ембриона от пиле може да се прилага при някои щамове на хриптени вируси от птичи тип А. Имаше полезен и чувствителен метод за откриване на вирусна инфекция, но трябва да се има предвид; възможността за заразяване на културите с темаглютиниране агенти, например,

възможността за наличието на вируса SV5 в културата на бъбречни клетки на маймуни. В допълнение, старите червени кръвни клетки са неспецифично адсорбирани върху бъбречните клетки в културата (Dowdle, Robinson, 1966). Had се използва широко като метод за титруване на грипната вирусна инфекция. Трябва да се отбележи, че щамовете, които претърпяват непълен цикъл на репликация в някои клетки гостоприемници, могат по-малко да причинят Had в тези култури.

Синтетичен хромогенен субстрат на невраминидаза 2- (3-метокеифенил) -N-ацетилневраминова киселина (MPN) (Tuppy, Palese, 1969) е използван за определяне на активността на невраминидазата в културата по време на репликацията на вируса на грипа. Palese et al. (1970) успява да идентифицира огнищата на размножаване на вируси в еднослойна култура чрез добавяне на MPN i диазониева сол на 4-амино-2,5-ди-метокси-4 / -нитроаз0'бензал. Эти фокусы окрашивались в красный цвет, поскольку 3-метоксифенол, освобождаемый из MPN под действием NA*, реагировал с диазониевой солью, давая красное окрашивание. Фокусы активности NA*, т. е. очаги размножения вируса, могли быть обнаружены этим методом даже при отсутствии локального цитопатического эффекта.

Этот метод может быть использован при изучении генетики. Palese и Schulman (1974) с помощью MPN-хромофорного метода идентифицировали два типа инфекционных очагов в однослойной культуре линии клеток 'Конъюнктивы человека, зараженной клонированным рекомбинантом вируса гриппа. Были обнаружены ярко и слабоокрашенные участки, соответствующие двум генетически различным компонентам вирусной популяции, имеющим соответственно высокое и низкое соотношение активностей NA* и НА*.

Метод ФА нередко используется для обнаружения антигенов вируса гриппа на поверхности /клеток. Необходимо, чтобы при этом оболочка клетки не повреждалась, что предотвращает проникновение в клетку реагентов. Rutter и Mannweiler (1973) описали появление вирусспецифических антигенных детерминант на (поверхности клеток HeLa, зараженных вирусом гриппа; при этом использовали непрямую иммунофлюоресценцию и нефиксированные клетки. Флюоресценцию обнаружив а ля на поверхности клеток через 4 ч; после заражения; через 8 ч она достигала максимума. Oxford (личное сообщение) обнаружил интенсивное свечение на поверхности зараженных клеток MDBK и первичной культуры клеток почки теленка при использовании антисывороток против очищенных NA* и НА*. На основании полученных данных невозможно было с достоверностью говорить о различном распределении этих антигенов на поверхности клетки, хотя флюоресценция при использовании сыворотки: против темаглютинина была сильнее, чем при использовании антинейра-минидазной сыворотки, что, видимо, указывает на большее количество НА на поверхности клетки по сравнению с количеством NA. Хотя Rutter и Mannweiler обнаружили «полярное» скопление антигенов вируса гриппа на одной стороне клетки, в опытах Oxford ;и НА* и NA* были распределены равномерно.

Для определения антигенов вируса гриппа на поверхности зараженных клеток с помощью электронной микроскопии Morgan и соавт. (1961) использовали иммуноферритиновый метод с применением противогриппозной сыворотки, конъюги-рованной с ферритином. Подобные методы можно применять и для специфической цдентификации антигенов на поверхности клеток при использовании антисывороток против очищенных вирусных антигенов: НА*, NA*, NP и белка мембраны..

в) Вирусные компоненты, освобождаемые из клеток. Освобождение синтезированных вирусных частиц с поверхности зараженных клеток осуществляется путем «почкования» на: протяжении длительного периода, начиная с 5—6-го часа после заражения. Зараженные клетки постепенно дегенерируют с развитием цитопатических изменений. Помимо вирусных частиц, в культуральную среду может выходить и «растворимый» Р-антиген. За выходом вируса и «растворимого» антигена можно следить, определяя наличие вирусспецифических компонентов в культур ал ьной жидкости но биологической активности, или по присутствию вирусепецифических антигенов. Чаще всего для определения динамики выхода вируса из клеток используют тест гемагглютинации (Hirst, 1941). Определение активности NA* применяют для этой щели лишь в тех случаях, когда ставится специальная задача. Оба этих.теста позволяют определить главным образом наличие вирусных частиц. Связывание комплемента (РСК) часто применяют для обнаружения вирусного антигена в культур а ль-ной жидкости, причем используют антитела к NP или антитела к поверхностным антигенам (У-антисыворотки). Могут быть использованы и антисыворотки к очищенным гемагглю-тинину и нейраминидазе. Ори этом обнаруживаются как вирусные частицы, так и свободные поверхностные антигены, в то врехМЯ как при использовании антител ок белкам NP я М выявляются в основнОхМ «растворимые» антигены, а не вирусные частицы. Характеристика етих систем при определении биологических свойств вируса и количественном измерении гриппозных антигенов описана в гл. 12.

Инфекционные вирусные частицы обнаруживают с помощью того или иного метода титрования инфекционности. Чаще всего применяют наиболее чувствительный метод определения конечной точки титрования «а куриных эмбрионах.. Заражение куриных эмбрионов описано в разделе II, Г этой

главы. Инфекционную 50% дозу для эмбрионов (ЭИД50) рассчитывают по количеству эмбрионов, зараженных три инокуляции каждого разведения, по обычной формуле (Reed, Muench, 1938). Титры выражаются в ЭИД50 на 1 мл жидкости. Титрование инфекционности можно проводить с использованием метода культивирования фрагментов хорион-аллантоисвой оболочки на скорлупе (Fazekas de St. Groth, White, 1958), который описан далее, однако этот метод менее чувствителен, чем титрование на эмбрионах. Титрование вируса можно также проводить в культуре клеток способом, аналогичным титрованию на эмбрионах, но с определением инфицирования культуры по гемадсорбции, как описано ранее.

Цитопатический эффект редко 'используется в качестве показателя заражения культуры вирусом гриппа. Эти эффекты (Pereira, 1961) варьируют в широких пределах у разных штаммов и на различных культурах. Поскольку они имеют обычно характер дегенеративных изменений с грануляцией цитоплазмы, вакуолизацией, пикнозом ядер, сморщиванием и дезинтеграцией клеток, конечная точка титрования не может быть определена с точностью. Описаны базофильные ци-топлазматические включения в клетках, зараженных вирусом гриппа А, но они тоже варьируют (Soloviev, Alekseeva, 1960). Базофильные цитоплазм а тичес<кие включения часто наблюдаются также в «летках, зараженных некоторыми штаммами вируса гриппа В (Porebska et al., 1968).

Для некоторых вирусов гриппа, как, например для FPV или для нейротронных вариантов человеческих штаммов NWS и WSN, определение инфекционности может быть осуществлено подсчетам бляшек в монослойной культуре клеток с использованием какой-либо из методик, описанных в разделе ИВ. При использовании метода бляшек можно знать его чувствительность по отношению к титрованию на эмбрионах. Для перечисленных выше штаммов это соотношение приблизительно равно 1 : 1, но для большинства штаммов, выделенных у человека, и для большинства используемых для бляшек систем относительная чувствительность низка.

Б. МЕТОД НЕГАТИВНЫХ КОЛОНИИ [БЛЯШКИ]

Способность вирусов гриппа к образованию бляшек широко варьирует. Многие вирусы не образуют бляшек, а те, которые образуют, имеют весьма низкую эффективность бляш-кообразования, в особенности вирусы гриппа А. Способность к образованию бляшек есть индивидуальный признак штамма вне зависимости от принадлежности к тому -или иному серотипу.

Было описано образование бляшек в первичных культурах фибробластов (Simpson, Hirst, 1961), легких (Granoff,1955) и почек (Wright, Sagik, 1958) журиносго эмбриона. Фиб-робласты куриного эмбриона успешно использовались главным образом в работе с нейротропным штаммом NWS и с несколькими многократно пассированными лабораторными штаммами вирусов гриппа типов А и В. Наоборот, клетка почек куриного эмбриона является неплохой системой для получения бляшек со многими штаммами вирусов гриппа типа A (Beare, Keast, 1974).

Образование бляшек некоторыми вирусами гриппа А и В в монослое клеток куриного эмбриона можно усилить обработкой клеток ферментами: панкреатином (Came et al., 1968) или трипсином (Tobita, Kjlbourne, 1974). Механизм действия этих протеолитичеоких ферментов неясен. Возможно, что они модифицируют поверхность клетки, делая ее более чувствительной к адсорбции и проникновению вируса,, или же разрушают какой-то ингибирующий фактор, ассоциированный с клеткой или остающийся после удаления среды роста, содержащей сыворотку.

Клетки почак сирийского хомяка были описаны в качестве системы, высокочувствительной к вирусам гриппа А (Grossberg, 1964), причем вирусы образовывали бляшки без 'предварительной адаптации. В дальнейшем, однако, о каких-либо опытах, проведенных с этими клетками, не сообщалось,

Две системы наиболее широко применялись для бляшко-образования с разными вирусами .гриппа: первичные культуры клеток почек обезьян и бычьих почак. 'Большинство штаммов вирусов гриппа типов А и В, выделенных и пассированных на других хозяевах, не образуют бляшек на клетках почек обезьян, однако многие штаммы могут 'быть адаптированы и начинают образовывать бляшки после нескольких пассажей (Henry, Youngner, 1957; Choppin, 1962). Было высказано предположение (Takemoto, Fabish, 1963), что неэффективное бляшкообразование вирусами гриппа типа А обусловлено торможением адсорбции вируса на клетках, вызываемым сульфатированными полисахаридами агара. У некоторых штаммов количество и размер бляшек значительно увеличи-. вались при добавлении ДЗАЭ-декстрана в агар для связывания ингибиторов. Этот ингредиент сейчас используется как: составная часть агарового слоя в большинстве систем.

Клетки почек теленка, как отмечал еще Lehmann-Grube:

(1963) и недавно подтвердили Веаге и Keast (1974), являют

ся высокоэффективной системой для бляшкообразования, вы

зываемого вирусом гриппа В. Однородность результатов,

полученных с разными штаммами гриппа В, контрастирует

с широко варьирующими результатами, получаемыми с раз

ными штаммами вирусов гриппа А. О необходимости адап

тации вируса гриппа А для получения бляшек в культуре

бычьих почек достоверных данных нет.

Из этих двух культур клетки 'почек обезьян обладают лучшими качествами в отношении роста и способности переносить лабораторные .манипуляции. Клетки 'бычьих почек хорошо растут, wo легко отделяются от стекла после образования 'ОПЛОШНОГО МОНОСЛОЯ.

Все первичные культуры «леток имеют общий недостаток — они неоднородны по составу и, -кроме того, чувствительность к вирусам может сильно 'различаться в культурах, полученных от разных особей. Некоторые клетки (в особенности «летки почек обезьян и бычьих почек) нередко оказываются жонтаминированнымипосторонними агентами. В 'принципе эти препятствия могут быть устранены при работе с ге-тероплоидной линией клеток. Вариант Wong—Kilbourne линии клеток Чанга (клетки конъюнктивы человека) был успешно использован для бляшкообразования с вирусами гриппа А и В ((Sugiura, Kilbourne, 1965). На клетках этой линии образуют бляшки и штаммы вируса гриппа типа A (H3N2) из клинического материала (Rytel, Sedmak, 1973). Хотя пассаж через гетероплоидную линию клеток делает вирус непригодным для изучения на людях или для живой вакцины, эти данные имеют существенное значение для генетических исследований и серологических тестов.

В. ОРГАННЫЕ КУЛЬТУРЫ

Однослойные и суспензионные культуры состоят из недифференцированных клеток и поэтому редко сохраняют спектр 'Чувствительности к вирусам, характерный для того органа, из которого они 'получены. Органные культуры представляют собой кусочки органов эмбриона или взрослого животного, поддерживаемые in vitro без пролиферации клеток и сохраняющие поэтому тот спектр чувствительности к вирусам, который данный орган имеет in vivo. ,По этой причине органные культуры оказываются весьма полезными системами для изучения in vitro взаимодействия между вирусом и чувствительными клетками хозяина.

Наиболее обширные исследования с 'использованием разных органных .культур, полученных от одного и того же вида животных (хорек), описаны в сообщениях Basarab и Smith (1969, 1970), Gould и соавт. (1972), Toms и со авт. (1974). Органные -культуры носовых раковин, мочевого пузыря, матки, трахеи, легких, конъюнктивы, яйцевода и пищевода обладали убывающей в этом порядке чувствительностью к вирусу гриппа A (H2N2), выращенному m куриных эмбрионах. Ткани пищеварительного тракта были нечувствительны, за исключением пищевода и глотки, которые могли быть заражены при использовании высокой дозы заражения. Нечувствительными оказались также мышечная, 'ретикулоэндотелиальная ткань, кровеносные сосуды и почка. В опытах, поставленных in vivo, при интраназальном заражении удавалось инфицировать только носовые раковины, легкие, трахею и пищевод, причем большая часть обнаруживаемого вируса содержалась в носовых раковинах. Мочевой пузырь и матка не были инфицированы, хотя, как было показано ранее, органные культуры этих тканей чувствительны к вирусу в такой же степени, <как и 'респираторные ткани. Оба этих органа могут -быть инфицированы при прямой урогенитальной инокуляции вируса (Basarab, Smith, 1970). Заражение урогенитальных тканей вирусом гриппа возможно не только у хорька. Rostoczy я соавт. (1973) обнаружили, что вирус гриппа типа А способен размножаться и в органной культуре эмбрионального эндометрия человека.

Поскольку ткани респираторного тракта являются главным 'местом размножения вируса in vivo, органные культуры, полученные из этих тканей, привлекали наибольшее внимание исследователей. Фрагменты слизистой с реснитчатым эпителием, полученные из трахеи и носовой полости ряда животных, оказались способными поддерживать весьма активную репликацию вируса гриппа; к фрагментам легочной ткани это относится в меньшей степени. Обсуждение использования органных культур для размножения вируса и перечисление использованных культур можно найти в обзоре Ноогп и Tyrrell (1969). Методы приготовления органных культур описаны там же, а также Cherry и Taylor-Robinson (1970).

Данные по оценке 'эффективности клеток реснитчатого эпителия для выделения вирусов гриппа весьма немногочисленны. В тех ограниченных исследованиях, которые проводились в этом направлении, не обнаружено заметных преимуществ органной культуры трахеи эмбриона человека перед первичной культурой почек макак резусов для выделения вирусов гриппа A (Roome et al., 1971) или В (Votava, Tyrrell, 1970).
Кроме того, культуру трахеи человека труднее получать и она менее удобна в обращении, чем обычные культуры клеток.

Было проведено сравнение органных культур трахеи куриного эмбриона с первичной культурой клеток почки зеленой мартышки для выделения вируса гриппа A (Blascovic et al., 1972b). Приблизительно одинаковое число штаммов было выделено в каждой системе, так же как в обеих системах. Авторы предложили использовать обе системы для выделения максимального количества штаммов. Использование органной культуры трахеи куриного эмбриона не сравнивали с обычным заражением куриных эмбрионов, которое несравненно проще.

Поскольку чувствительность тканей к вирусам в органных культурах подобна таковой в интактном организме, по-

лагают, что и действие противовирусных веществ должно быть сходным. Если это так, то органные культуры должны оказаться полезными для оценки действия противовирусных препаратов. Здесь, однако, имеются как положительные, так и отрицательные стороны. 'С одной стороны, фрагмент органа, удаленный из организма, не подвергается нормальной физиологической регуляции, что может отразиться на эффективности препарата. С другой стороны, концентрация препарата и продолжительность контакта могут лучше контролироваться в органных культурах. Tyrrell и соавт. (1965) первыми использовали реснитчатый эпителий человека в органной культуре для оценки in vitro действия противогриппозного препарата (амантадин). Herbst-Laier (1970) исследовал широкий круг органных культур, включая эксплантаты трахеи мышей, хомяков, хорьков, крыс, собак, обезьян, свиней « телят, а также носовых раковин собак и хорьков. Из них наиболее пригодными для оценки размножения (и его подавления) прототипных штаммов вирусов типов А и В оказались органные культуры трахеи собак и хорьков. В культуре трахеи собак обнаруживались специфические гистологические изменения, которые автор рассматривает как более надежный критерий оценки, чем титр вируса как таковой. Характерные и постоянные цитопатические изменения были также обнаружены Blascovic и соавт. (1972а) в органных культурах трахеи куриного эмбриона, зараженных вирусом гриппа А (Гонконг/68); это позволяет полагать, что и данная культура может оказаться полезной.

Использование органных культур реснитчатого эпителия было предложено для определения спектра хозяев вновь выделенных штаммов вируса гриппа A. Schmidt и соавт. (1974) сообщили, что при заражении таких культур, полученных из органов кур, лошадей, хорьков и свиней, вирусами, выделенными 'у. людей, свиней лошадей и птиц, чувствительность культур коррелировала с пассированием штамма в том или ином хозяине в природных условиях.

Органные культуры могут быть использованы и для отбора штаммов-кандидатов для получения живых вакцин. Mos-tow и Tyrrell (1973) описали определенную корреляцию меж-'ду способностью вируса снижать подвижность ресничек эпителия и повреждать клетми в органной культуре трахеи эмбриона человека и его способностью вызывать заболевание у людей. Эта корреляция, однако, не наблюдалась с органными культурами хорьков и не распространялась на все штаммы вирусов гриппа (Нага et al., 1974). Вирусы гриппа типа В обнаружили одинаковую патогенность для органных культур трахеи человека при различной вирулентности для людей. Поэтому представляется очевидным, что, хотя органные культуры имеют много достоинств для вирусологических

исследовании, нельзя считать, что орган, разрезанный на кусачки и поддерживаемый вне организма в искусственной среде, реагирует на инфекцию точно так же, как в интактном организме.

Г. КУРИНЫЙ ЭМБРИОН

Куриные эмбрионы широко используются для выделения и размножения вируса еще со времени первого описания заражения в полость амниона (Burnet, 1940). Классическая работа Beveridge и Burnet по культивированию вирусов и рик-кетсий в курином эмбрионе была опубликована в 1946 г. С тех пор почти не было получено существенных дополняющих данных.

Некоторые ранние рекомендации сейчас выглядят, однако, устаревшими в связи с биологической изменчивостью вирусов гриппа. В 40чх тодах для выделения вирусов гриппа типов А и В рекомендовалось заражение 13—14-дневных эмбрионов в полость амниона, а для адаптированных в лаборатории штаммов — заражение в полость аллантоиса 10— 12-дневных эмбрионов. Вплоть до 1968 г. выделение вирусов гриппа А и В можно было осуществить, как правило, лишь посредством заражения в полость амниона и для успешной адаптации требовалось много пассажей. Очень редко выделяли штамм путем заражения в полость аллантоиса. С 1968 г. человеческие штаммы вируса гриппа А выделяются с одинаковой легкостью при обоих путях заражения: введение материала в полость амниона не дает никаких преимуществ. В отношении вируса гриппа типа В на протяжении многих лет тоже можно наблюдать изменения. Поскольку трудно предсказать заранее предрасположение штамма того или другого вируса к размножению при определенном способе введения, в качестве стандартной процедуры рекомендуется заражение 11-дневных эмбрионов в полость как амниона, так и аллантоиса.

Неадаптированные вирусы, введенные в амнион 13-дневных эмбрионов, размножаются первоначально в трахее и легких. Они могут вызывать гибель эмбриона, но могут и не вызывать ее .Вирусы, многократно пассированные этим путем, размножаются в амниотической оболочке и эпителиальных покровах эмбриона, а также в респираторных путях, вызывая множественные кровоизлияния и быструю гибель его. После нескольких пассажей штамм приобретает способность размножаться при заражении в полость аллантоиса.

Штаммы, не адаптированные к куриному эмбриону (фаза О—от original, т. е. исходная), нередко дают более высокие титры гемагглютинина с эритроцитами морской свинки или человека, чем с куриными эритроцитами. 'После адаптации (фаза D — от derived, т. е. производное) вирус обычно

агглютинирует куриные эритроциты до тех же титров, что эритроциты млекопитающих. Этот переход из фазы О в фазу D (Burnet, Bull, 1943) наблюдается не 'всегда. Большинство штаммов вирусов гриппа А и В, выделенных после 1968 г., агглютинируют эритроциты морокой свинки и куриные эритроциты до одинаковых титров.

Адаптированные вирусы, введенные в полость аллантоиса Подневного куриного эмбриона, размножаются предже всего в энтодермальных -клетках хорион-аллантоисной оболочки, хотя вирус можно обнаружить также в клетках амниотиче-ской оболочки и респираторных путей.

Накопление вируса в полости аллантоиса имеет очевидные преимущества, поскольку получается большой объем вирусеодержащего материала и его легко собирать. Хорошо адаптированные штаммы могут давать 109—1011 вирусных частиц на 1 мл. Вирус одинаково хорошо размножается в эмбрионах от 10- до 13-дневното возраста, но объем аллан-тоиеной жидкости резко уменьшается, начиная с 13-го дня. Кроме того, у эмбрионов 'более раннего возраста содержится меньше солей мочевой кислоты ш аллантоисной жидкости; по мере развития эмбриона их содержание нарастает. Эмбрионы, зараженные в 12—'13-дневном возрасте, содержат аллантоисную жидкость, которая мутнеет сразу после охлаждения; за несколько дней в ней образуется обильный осадок. Осадки -солей мочевой кислоты содержат вирус и их образование может резко снижать титр вируса в жидкости.

Величина заражающей дозы вируса -может существенно влиять на его урожай. Рекомендуется использовать дозы от 104 до Ю5 ЭИД50 на 1 мл. При использовании более низкой дозы урожай вируса может быть низким, а динамика репродукции— неравномерной. Более высокие заражающие дозы могут вести ,к снижению урожая (Miller, 1944). При этом может также развиваться эффект фон Магнуса (von Magnus, 1952), т. е. увеличение отношения неинфекционных частиц <к инфекционным. Этот феномен обсуждается в гл. 1.

Для некоторых специальных исследований может оказаться необходимым культивирование (вируса в клетках оболочки аллантоиса без репродукции вируса в других тканях эмбриона. Для'таких исследований могут использоваться .деэмбрио-нированные яйца (Bernkoff, 1949). Однако урожай вируса в них гораздо ниже, чем в ннтактных эмбрионах, и этот метод не может быть рекомендован для постоянного использования.

Д. ФРАГМЕНТЫ ХОРИОН-АЛЛАНТОИСНОЙ ОБОЛОЧКИ НА ЯИЧНОЙ СКОРЛУПЕ

Поскольку эксперименты, требующие заражения большого числа куриных эмбрионов, дороги и трудоемки, преимущества техники, позволяющей провести такой же опыт с исполь-

зованием фрагментов одного яйца, очевидны. При этом достигается и однородность ткани, поскольку снимается проблема неодинаковой чувствительности разных эмбрионов к вирусу.

Fulton и Armitage (1951) первыми предложили способ разрезания хорион-аллантоисной оболочки (ХАО) на маленькие кусочки и их поддержания в чашках на пластиковых досках, но титры вируса при этом (были значительно ниже, чем в интактном эмбрионе. Fazekas de St. Groth и White (1958) улучшили методику, изменив среду и использовав кусочки, не отделенные от скорлупы. (При этом скорлупа забу-феривала среду и служила опорой для ткани; экспонировалась максимальная поверхность, причем только та сторона оболочки, которая чувствительна к вирусной инфекции. Инфекционные титры большинства штаммов гриппа А в такой системе не уступают титрам :в интактном эмбрионе. Размножение вируса гриппа В шло менее успешно. Эта методика особенно удобна для титрования инфекционности и для реакции нейтрализации с вирусом гриппа А, а также для быстрого выделения и клонирования рекомбинантов вирусов гриппа A (Webster, 1970).

Ш. КРУГ ХОЗЯЕВ СРЕДИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

А. ХОРЬКИ

Вирус гриппа человека А был впервые выделен на хорьках (Smith et al., 1933). С тех лор хорькам уделяли много внимания, сначала как средству выделения вируса, а позднее как модели для изучения патогенности и иммунологии гриппа.

Хорьки высоковосприимчивы к заражению вирусами гриппа типа А. Интраназальное введение инфекционного вируса вызывает через 48 ч температурную реакцию, которая может длиться от 24 до 72 ч. У животных в этот период развиваются симптомы гриппа: ринит, чиханье, насморк, потеря аппетита, вялость. Вирус выделяется во внешнюю среду на протяжении первых дней заболевания и легко может передаваться незараженным хорькам и людям (Smith, Stuart-Harris, 1936). Хорьки могут заражаться от человека естественным путем при контакте, поэтому при экспериментальном заражении следует заранее убедиться ш отсутствии у них антител к циркулирующим среди людей вирусам гриппа.

Сообщалось, что хорьки были высокочувствительны к вирусам гриппа А, преобладавшим в середине 30-х годов, но менее чувствительны к более поздним штаммам НО, к штаммам HI и к вирусу гриппа В (Hirst, 1947b; Sugg, Nagaki,1955). Возможно, что это действительно так, но сколько-нибудь систематических исследований по использованию хорьков для выделения вирусов А и В не проводилось после начала 40-х годов. К тому времени техника использования куриных эмбрионов получила широкое распространение, и, естественно, применение, хорьков для выделения вируса 'вышло из употребления.

Хорьки, однако, остаются широко используемой моделью для изучения гриппа человека. Картина заболевания у хорьков весьма сходна с таковой у человека (Shope, 1934, Francis, Stuart-Harris, 1938; Liu, 1955; Sugg, Nagaki, 1955; Haff et al., 1966). Разные штаммы вирусов гриппа вызывают широкий спектр аслинических проявлений болезни. Реакция на заражение варьирует от лепкой бестемпературной респираторной инфекции с очаговыми гистологическими изменениями в передней части носовых ходов (Haff et al., 1966) до острой температурной реакции с быстрым развитием некроза и отторжением клеток реснитчатого эпителия (Shope, 1934; Francis, Stuart-Harris, 1938) и даже до вирусной пневмонии с .разрушением клеток, выстилающих альвеолы (Hers, 1963; Mulder, Hers, 1972). Ранее с помощью световой микроскопии ^полученные данные о вирусопецифичееких патологических изменениях эпителия дыхательных путей были позднее подтверждены электронно-микроскопическими исследованиями (Hotz, Bang, 1957) и методом флюоресцирующих антител (Liu, 1955).

При интраназальном заражении вирус размножается в носовых раковинах, легких, трахее, пищеводе (Haff et al., 1966; Basarab, Smith, 1969). Вирус обнаруживался только в этих тканях, хотя другие (мочевой пузырь, матка, конъюнктива) тоже восприимчивы ж нему. Преимущественное размножение вируса в тканях респираторных органов наблюдается даже при внутривенном или внутрисердечном введении вируса (Basarab, Smith, 1969). Преимущественное заражение именно респираторной ткани было также подтверждено Barber и Small (1974) в опыте, при котором сформированная хирургическим путем сумка из ткани трахеи пересаживалась под кожу. Вирус поражал как трахею, так и имплантированную ткань трахеи независимо от пути заражения. Пассивная иммунизация сывороткой хорьков, содержавшей антитела против вируса, не предотвращала распространение вируса гематогенным путем.

Заражение хорьков вирусом гриппа к повышению содержания белка и кратковременному появлению нейтрализующих антител в смывах из носа, <а также к быстрому подъему уровня нейтрализующих антител IB сыворотке. После выздоровления хорьки иммунны к повторному заражению гомологичным вирусом (Smith et al., 1933; Francis, Stuart-Harris,

1938; Haff et al., 1966; Marois et al., 1971). Поскольку это весьма близко напоминает реакцию на заражение у человека, возобновился интерес к удобной модели для изучения иммунитета и методов иммунизации. Potter et al. (1972a, b) и Potter (1973) в серии сообщений описали отсутствие защитного эффекта при внутримышечном введении водной инактивиро-ванной вакцины. Иммунизация с использованием адъюванта обеспечивает некоторую степень защиты и вызывает подъем уровня антигем-агглютининов в сыворотке, но иммунитет при этом не столь выражен, как после перенесенного заболевания. Это в общем соответствует данным, полученным на людях, и позволяет полагать, что отсутствие полного иммунитета при использовании убитой вакцины обусловлено ее неспособностью вызывать появление антител в секрете слизистой оболочки носа. Антитела в смывах из носа постоянно обнаруживаются при естественном заболевании (Haff, 1973).

Б. ГРЫЗУНЫ

Белые швейцарские линии мышей использовались как лабораторная (модель для изучения вирусов гриппа человека на протяжении 40 лет (Andrewes et al., 1934; Francis, 1934). Преимущества использования мышей очевидны: малые размеры и низкая стоимость допускают такие лабораторные исследования, которые были бы невозможны при использовании более крупных и дорогих животных, например хорьков.

В отличие от хорьков мыши не обладают высокой восприимчивостью к вирусу гриппа. Интраназалыное введение инфекционного материала от больных людей не вызывает выраженной картины заболевания у мышей, хотя вирус может размножаться в легких, бронхиолах, трахее и, в меньшей степени, тканях носовой полости (Hirst, 1947a; Lida, Bang, 1963; Mulder, Hers, 1972). Поскольку размножение вируса может быть засвидетельствовано лишь посредством титрования in ovo или in vitro, нельзя считать, что выделение (вируса путем заражения мышей имеет какие-либо преимущества.. Однако после адаптации, требующей шести или более пассажей легочного экстракта, вирусы гриппа типа А начинают вызывать ярко выраженные патологические изменения в легких, а также гибель животных уже через 48 ч после интра-назального заражения. Вирусы гриппа типа В труднее адаптировать к легким мыши. Эти выраженные патологические изменения, вызываемые вирусом трилпа А, .являются генетическим признаком, но которому идет отбор, причем этот признак независим от способности вируса размножаться в легких. Высокие титры вируса могут быть получены в легких при заражении неадаптированным штаммом, но размноже-

ние при этом не 'ведет к развитию патологических изменений и гибели (Hirst, 1947a).

Несколько иная картина наблюдается яри адаптации к мышам вируса, выращенного в курином эмбрионе. Первое интраназалыгое заражение обычно вызывает развитие (поражений в леших и гибель животного, в то время как несколько последующих пассажей не вызывают патологических изменений. Это явление можно объяснить токсичностью массивной дозы вируса, который (присутствует в аллантоисной жидкости в высокой концентрации. В организме мышей накапливается при этом очень мало вируса (Sugg, 1950). Специфические поражения легких и гибель мышей отмечаются лишь после 4—10 дополнительных пассажей легочной ткани.

Поражения легких, вызываемые вирусами гриппа у мышей, представляют собой настоящую вирусную пневмонию, похожую во (Многих отношениях на вирусную пневмонию у человека (Loosli, 1949; Mulder, Hers, 1972). Данные, полученные ранее с помощью световой микроскопии и указывавшие на специфическое поражение клеточного покрова альвеол, были подтверждены методом флюоресцирующих антител (Albrecht et al., 1963) и электронной микроскопией (Plum-raer, Stone, 1964). Хотя юсе клетки респираторного тракта чувствительны к 'вирусу, имеются данные о том, что у человека (см. гл. 13) клетки алывеол являются местом первоначального размножения вируса (Albrecht et al., 1963). Этот необычный восходящий путь респираторной инфекции, возможно, является скорее кажущимся, чем реальным. Когда животному под наркозом интраназально вводят вирус, он распределяется по всему респираторному тракту. Размножение вируса может -быть более быстрым в легких, чем в реснитчатом эпителии верхних дыхателыных путей.

При сублетальной инфекции вирус начинает исчезать из легких через 7 дней, что совпадает с появлением гуморальных антител. В процессе выздоровления эпителий альвеол замещается цилиндрическими и кубическими клетками .реснитчатого эпителия бронхиол. Наблюдается также метаплазия с появлением плоского эпителия (Baskerville et a]., 1974).

Поскольку воздушно-капельная передача инфекции от зараженных животных к незараженным происходит >в течение нескольких дней контакта, мыши .представляют собой прекрасную модель для изучения передачи вируса (Schulman, 1969). Мыши широко применялись также для изучения вакцин (Eddy, 1947; Kage et al., 1969), механизмов иммунитета (Schulman et al., 1968) и противовирусных препаратов (Da-vies et al., 1966; Suganuma, Ishida, 1973).

Вирусы гриппа типа А легко размножаются в легких хомяков при минимальных признаках заболевания (Friedewald, Hook, 1948). Те немногие штаммы вируса гриппа В, которые изучались в этом отношении, обладали лишь незначительной патогенностью, «о после адаптации могли вызывать поражения легких (Friedewald, Hook, 1948; Davenport, 1951; Kilbour-ne et al., 1951). В связи с низкой патогенностью вирусов гриппа для хомяков эти животные редко использовались для экспериментальных работ по гриппу. Однако недавно было обнаружено, что хомяки особенно удобны для оценки темпера-турочувствительных штаммов как пригодных для использования в качестве вакцины '(Mills, 'Chanock, 1971). Хомяк — одно из немногих лабораторных животных, имеющих температуру тела 37°С. Как и у хорьков, у хомяков не вырабатываются антитела при введении водной вакцины, если только не было предварительного заражения вирусом гриппа типа А (Potter et al., 1973).

Некоторые другие грызуны также использовались. Stuart-Harris (1937) сообщил, что вирус (гриппа может размножаться в ткани носовых раковин крыс и морских свинок, но не вызывает деструкции эпителия.

В. ПРИМАТЫ (ПОМИМО ЧЕЛОВЕКА)

Использование обезьян в качестве экспериментальной модели для изучения гриппа шло с переменным успехом. Еще в 1937 г. Mclntosh и Selbie пытались вызвать заболевание у макак резусов и зеленых мартышек вирусом H0N1, но безуспешно. Заражение макак резусов и циномольгус вирусом A/FM/1/47 .(.H1N1) дало такой же результат. Клинических проявлений болезни не наблюдалось, но были отмечены характерный некроз и десквамация эпителия (Verlinde, Makste-nieks, 1954).

Saslaw и Carlisle (1965) сообщили, что при заражении аэрозолем удается получить более четкие результаты; этот путь заражения они рассматривали как более естественный, чем интраназальный или интратрахеальный. Они смогли заразить обезьян макак (резусов и циномольгус вирусом типа A/PR8/34 (H0N1). Попытки заразить обезьян штаммами вируса H2N2 и вируса гриппа В были безуспешными. Berendt (1974) тоже использовал аэрозоли с малым размером частиц и сообщил, что у 6 макак резусов, зараженных вирусом типа А/Гонконг/68 (H3N2), наблюдалось выделение вируса во внешнюю среду и (появление антител. Явных клинических проявлений болезни не было. Все животные были иммунны к повторному заражению.

Кенийские павианы (Papio sp.) оказались чувствительными к заражению штаммом H3N2, подобным А/Гонконг/68 (Kalter et al., 1969). Вирус был обнаружен в смывах из глотки; кроме того, у зараженных животных и у животных, со-

державшихся в соседних клетках, появились антитела к вирусу. Клинически выраженного заболевания не было.

Среди приматов гиббоны, ©идимо, потенциально являются одной из наиболее удачных .моделей гриппа (Johnsen et al., 1971). Небольшая группа животных, зараженных штаммом А/То'Нконг/68, не проявила явных 'признаков болезни, но через 2—3 нед респираторные заболевания распространились по всей колонии гиббонов. Отмечались ринит, кашель, депрессия, похудание, желудочно-кишечные расстройства. Болезнь продолжалась в среднем 3—6 дней и выздоровление иногда затягивалось. Четыре гиббона погибли. Спектр клинических проявлений был весьма близок к наблюдаемому у людей. Вторая группа животных, получившая вирус А/Япо-ния/305/57 (H2N2), не заразилась.

В большинстве случаев для заражения обезьян использовались лабораторные штаммы, прошедшие много пассажей в куриных эмбрионах, мышах, хорьках или последовательно на разных объектах. Обезьяны, возможно, были столь же чувствительны к этим штаммам (вероятно, аттенуираванным), как человек. Можно ли успешнее заразить обезьян при использовании вируса, непосредственно полученного у людей, неизвестно. Серологические исследования, проведенные на зеленых мартышках и макаках резусах вскоре лосле их поимки, показали высокий процент антител к H3N2, начиная с 1968 г. (O'Brien, Tauraso, 1973). Сообщение Murphy и со-авт. (1972) тоже было интересным: они описали вспышку, вызванную вирусом, подобным А/Гонконг/68 у обезьян мар-мозет из Колумбии, которая началась до прибытия партии обезьян в лабораторию. Эти данные показывают, что вирус гриппа А человека .может вызывать вспышки у обезьян в определенных условиях, но высокая частота передачи инфекции, возможно, свойственна только вирусу Гонконг.

Г. ТЕЧЕНИЕ БОЛЕЗНИ В УСЛОВИЯХ ПОДАВЛЕНИЯ ИММУНИТЕТА

Воздействия на системы иммунитета у зараженных гриппом животных могут представлять интерес в аспекте повышения чувствительности к инфекции у экспериментальных животных и приобретения чувствительности у невосприимчивых хозяев. Однако сообщений о таких исследованиях немного и опубликованные данные противоречивы. Сообщалось (Singer et al., 1972), что у мышей, подвергнутых действию циклофосфамида, уменьшалась тяжесть заболевания, вызванного вирусом A/PR8. Наоборот, Virelizier и соавт. (1974) нашли, что мыши, получившие циклофосфамид, намного чувствительнее к летальному действию A/PR8, чем, нормальные линии: титр препарата вируса в LD50 был по крайней мере

в 100 раз выше у .мышей, обработанных циклофосфамидом'. Mayer и соавт. (1973) тоже обнаружили, что иммуносунпрес-сия, вызванная циклофосфамидом, усиливает нейровирулент-ность вируса A/NWS. Результаты этих двух работ позволяют полагать, что гуморальные антитела являются важным фактором в выздоровлении мышей при гриппозной инфекции. Мыши с удлиненной вилочковой железой были несколько чувствительнее к вирусу PR8, чем нормальные мыши (Virelizier et al., 1974). Исследование на курах с удаленной фабри-циевой сумкой показали (Portnoy et al., 1973), что у них повышалась чувствительность к заражению ВЧП; это рассматривалось как указание на роль гуморальных антител в выздоровлении от этой инфекции.

IV. ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСА

Пробы для выделения вируса следует брать не позднее чем через 3 дня после начала заболевания. Вероятность выделения вируса быстро снижается после этого срока, но в некоторых случаях вирус можно выделить на 7-й и даже 10-й день болезни. Лучше всего вирус выделяется из носовых смывов. Однако мазки, взятые из глотки и носа, 'более удобны для врача и менее неприятны для больного. Пробы, предназначенные для выделения вируса, следует постоянно держать на холоде и как можно скорее использовать. Если нельзя инокулировать их в течение 48 ч после взятия, следует поместить пробы в закрытый сосуд и .хранить в сухом льду или в рефрижераторе при —70 °С. В летальных случаях при подозрении на гриппозную пневмонию следует пытаться выделить вирус из ткани легких, слизистой трахеи, а также крови. В этих случаях выделение вируса осуществлялось с переменным успехом (iDowdle, Coleman, 1974).

Вирусы гриппа А и В размножаются в куриных эмбрионах и у ряда лабораторных животных. Куриные эмбрионы и культуры клеток точек макак резусов и зеленой мартышки считаются наиболее чувствительными для выделения вируса. Вирус гриппа типа С выделяли только на куриных эмбрионах.

Для максимально успешного выделения вирусов следует заражать 10—11-дневные эмбрионы одновременно в полости амниона и аллантоиса. Эмбрионы инкубируют при 33 °С 3— 4 дня и пробы амниотической и аллантоисной жидкости проверяют на наличие вируса, добавляя эритроциты кур или морских свинок. Эритроциты морской свинки (или группы крови 0 человека) считаются более чувствительными, чем куриные, для обнаружения вирусов H0N1 и H1N1 на ранних пассажах в курином эмбрионе. Это не относится к вирусам,

распространенным в -настоящее время: они -одинаково агглютинируют и те и другие эритроциты. Куриные эритроциты имеют некоторые преимущества: быстрее оседают, чем эритроциты (млекопитающих, титры гемагглютинации их легче учитываются и они менее 'подвержены неспецифической агглютинации сыворотками млекопитающих. В некоторых случаях необходимы два или три «слепых» амниотических иас-сажа, прежде чем вирус достигает титра, достаточного для гемагглютинации. Если вирус размножается или легко адаптируется к размножению при инокуляции в иолость аллан-тоиса, амниотичеекие пассажи не требуются.

Для выделения вируса гриппа типа С 7-дневные куриные эмбрионы заражают в полость амниона и инкубируют при 33°С 5 дней. В полости аллантоиса вирус плохо накапливается даже после (многочисленных пассажей на эмбрионах.

Клетки почек зеленых мартышек или макак резусов в мо-нослой'ной культуре в пробирках являются наиболее чувствительной культуральной системой для выделения вирусов гриппа А и В. Неопецифическое (подавление вирусов веществами, содержащимися в сыворотках в культуральной среде, является серьезной проблемой; монослой следует несколько раз промыть средой без сыворотки и использовать такую среду для поддержки культуры после заражения. Вирусы гриппа А хуже растут в культурах клеток, чем вирусы гриппа В. Цитопатический эффект проявляется в виде накопления вакуолизирующихся клеток, которые затем дегенерируют или отделяются от стекла. Цитопатический эффект проявляется в виде накопления вакуолизирующихся клеток, которые затем дегенерируют или отделяются от стекла. Цитопатический эффект слабовыражен, непатогнамоничен, может не выявляться при первых пасса'жах. Присутствие вируса обычно устанавливается гемадсорбцией эритроцитов морской свинки (Vogel, Shelokov, 1957) в течение 3—4 дней после заражения, задолго до развития выраженного цитопатического эффекта.

Большинство выделяемых штаммов вируса гриппа типа В может быть обнаружено гемадсорбцией или тем агглютинацией в течение 3—4 дней после заражения. Цитопатический эффект обычно тоже заметен. Клетки становятся зернистыми, набухают, округляются; позднее развиваются пикноз и фрагментация, слой клеток в конце концов разрушается. Развитие цитолатичесшго действия, и накопление (гемагглютининов могут быть ускорены для вирусов А и В, если поместить пробирки во вращающийся барабан, хотя вероятность выделения вируса от этого не увеличивается.

Следует одновременно культивировать незараженные культуры клеток в пробирках, чтобы исключить возможность случайной контаминации вирусами. Вирус парагриппа типа 2 (SV5), вызывающий гемадсорбцию, является нередким кон-

таминантом в культурах почек макак резусов. Неспецифическая адсорбция старых эритроцитов характерна для большинства культур почечных клеток и может быть ошибочно принята за указание на присутствие вируса (Dowdle, Robinson, 1966), поэтому для гемадсорбции должны использоваться только свежие эритроциты. Большинство культур клеток почки макак резусов содержит вирусы типов SV40 и SV13 («пенящий» вирус). Хотя присутствие этих агентов нежелательно и может помешать интерпретации цитопатического эффекта, они не влияют, 'видимо, на чувствительность клеток •к вирусам гриппа при их выделении.

Трудно оценить количественно эффективность выделения вирусов гриппа А и В в культуре ткани и на эмбрионах. Обилие выделяемых штаммов обоих вирусов сильно варьирует по годам. Вообще говоря, культура клеток почек обезьян имеет преимущество при выделении вирусов В, но степень этого (преимущества варьирует. Вирус А еще более вариабелен и для него куриные эмбрионы чувствительнее клеточных культур. |По этой причине, а также в связи со значительной биологической (как и антигенной) изменчивостью вирусов гриппа не всегда можно сказать заранее, какой метод выделения окажется более эффективным. Заражение первичных культур почек макак резусов или зеленых мартышек одновременно с заражением куриных эмбрионов в полость аллан-. тоиса и амниона рекомендуется для выделения максимального количества штаммов вирусов гриппа А и 'В.



СПРАВКА

Albrecht P., Blaskovic D., Styk В., Roller M. Acta virol. (Prague), 1963

Andrewes С. Н., Laidlaw PP, Smith W. Lancet, 1934, v. 2, p. 859. Barber WH, Small PA Infect. Immunity, 1974, v. 9, p. 530. Basarab O., Smith H. Brit. J. exp. Path., 1969, v. 50, p. 612. Basarab 0., Smith H. Brit. J. exp. Path., 1970, v. 51, p. 1. Baskerville A., Thomas G., Wood M., Harris WJ Brit. J. exp. Path., 1974,v. 55, p. 130.

Beare AS, Keast KAJ gen. Virol., 1974, v. 22, p. 347

Becht И. J. gen. Virol, 1969, v. 4, p. 215.

Berendt RF Infec. Immunity, 1974,

Bernkoff H. Proc. Soc. exp. Biol., 1949, v. 72, p. 680. Boveridge WI В., Burnet FM Med. res. Counc. (Gt. Brit.). Spec. Rep. Ser.,

J946, v. 256. Blaskovic P., Rhodes AJ, Labzoffsky NA Arch. ges. Virusforsch., 1972

Blaskovic P., Rhodes AJ, Labzoffsky NA Arch. ges. Virusforsch., 1972b,

Bd 39, S. 299.

Burnet FM Aust. J. exp. Biol. Med. Sci., 1940, v. 18, p. 353. Burnet FM, Bull D. «.Aust. J. exp. Biol. Med. Sci., 1943, v. 21, p. 55. Came PE, Pascale A., Shimonaski G. Arch. ges. Virusforsch., 1968, Bd 23
<< Предишна Следващ >>
= Преминете към съдържанието на учебника =

Культивирование вирусов гриппа человека в лабораторных условиях, круг хозяев среди лабораторных животных и выделение вируса из клинического материала

  1. ВЗЯТИЕ, УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ДОСТАВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
    Доставка клинического и биохимического материала в клинико-диагностическую лабораторию Выполняя лабораторные исследования, работники лаборатории стремятся к наиболее точному воспроизведению аналитических процедур для получения достоверного результата анализа, однако из практики работы любой лаборатории известно: результаты лабораторных анализов не всегда правильны. Среди многочисленных факторов,
  2. Кильбурн Э.Д.. Вирусы гриппа и грипп (1978), 1978
    Книга посвящена обзору разнообразных вирусов гриппа, их культивированию, биохимии и особенностям молекулярного устройства. Содержание: Вирусы гриппа и грипп. Структура вируса гриппа. Биологично активни протеини за грипни вируси. Гемагглютинин. Биологично активни протеини за грипни вируси. Нейраминидаза. Активность транскриптазы в клетках и вирионах гриппа. Рибонуклеиновые кислоты вирусов
  3. Приложение 4 Инфекция, вызванная вирусом гриппа A(H5N1) («Птичий грипп»)
    Грипп птиц — высококонтагиозная вирусная инфекция, которая может поражать все виды пернатых. Из домашних видов наиболее чувствительны индюки и куры. Дикие виды птиц могут служить переносчиками инфекции. Естественным резервуаром для вирусов гриппа птиц (ВГП) являются водоплавающие птицы, которые чаще всего ответственны за интродукцию инфекции в домашние хозяйства. Этиология. ВГП принадлежат к
  4. Руководящие принципы ВОЗ по взятию образцов у животных для лабораторной диагностики инфекции гриппа (от 12 января 2005 г.)
    Общая информация Успешное проведение диагностики вирусных инфекций, в значительной степени, зависит от качества образцов и условий, в которых они перевозились и хранились до проведения их исследований в лаборатории. Образцы для выделения респираторных вирусов в клеточных культурах или куриных яйцах с развивающимися эмбрионами и для прямого выявления вирусных антигенов или нуклеиновых кислот,
  5. Структура вируса гриппа
    П. В. ШОППИН И Р. В. КОМПАНС (PW CHOPPIN, Я. W. COMPANS) I. ВВЕДЕНИЕ Изучение вируса гриппа в течение длительного времени находилось «а передовом рубеже структурных исследований в вирусологии. Вирус гриппа одним из первых был изучен: помощью электронной микроскопии (Taylor et al., 1943), и при использовании именно этого объекта в качестве модели было "оказано, что некоторые вирусы
  6. Антигенная изменчивость вируса гриппа
    Р. Г. ВЕБСТЕР и У. Г. ЛЕИВЕР i(RG WEBSTER and WG LAYER) I. ВВЕДЕНИЕ Вирус гриппа типа А1 является уникальным среди 'возбудителей инфекционных заболеваний человека вследствие своей способности столь сильно изменять собственную антигенную структуру, что специфический иммунитет, приобретенный в ответ «а заражение одним штаммом, очень слабо либо совсем не защищает от следующего
  7. Репликация вируса гриппа
    К. ШОЛТИССЕК и Х.-Д. КЛЕНК (СН. SCHOLTISSEK, H.-D. KLENK) I. ВВЕДЕНИЕ По проблеме репликации вируса гриппа существует ряд обзоров. Литература до 1968 г. обобщена в статьях Hoyle (1968) 'и Scholtissek (1969); более поздними работами являются обзоры White (1973), а также Compans и Choppin (1974). Большинство данных по репликации получено при 'изучении вируса гриппа типа А. Существенных
  8. Биологически активные белки вируса гриппа. Активность транскриптазы в клетках и вирионах гриппа
    Р. В. ОИМПСОН и В. Д. БИН (RW SIMPSON, WJ BEAN, JR.) I. ВВЕДЕНИЕ Эта глава «освящена довольно новому разделу в биологии вируса гриппа, в связи с чем большая часть информации фрагментарна по -своему составу си включает большое число нерешенных вопросов. Основное утверждение, на котором основывается данная глава, состоит в том, что микоовирусы являются вирусами с негативным геномом
  9. Генетика вируса гриппа
    А. СУГИУРА (A. SUGIURA) I. ВВЕДЕНИЕ. ИСТОРИЧЕСКИЙ ОБЗОР Данная глава написана не с целью дать обзор всей литературы, относящейся ж исследованию генетики вируса гриппа. Более подробно это сделано в обзорах Kjlbourne (1963) и Hoyle (1968). Я попытался проследить, стараясь придерживаться хронологического порядка, только за теми данными, которые непосредственно привели к важным концепциям и
  10. Рибонуклеиновые кислоты вирусов гриппа
    М. В. ЛОНС (М. W. PONS) I. ВВЕДЕНИЕ Вирус гриппа имеет уникальный по сравнению с другими вирусами животных спектр биологических свойств. Он обладает способностью .к множественной реактивации (Hoyle, Liu, 1951), образованию неполных вирусных частиц (von Magnus, 1954), чувствителен к антиномицину D (Barry et al., 1962), его нуклеиновая кислота неинфекционна -и он обладает способностью к
  11. Биологически активные белки вируса гриппа. Гемагглютинин
    И. Т. ШУЛЬЦ (I. Т. SCHULZE) I. ВВЕДЕНИЕ ТОТ факт, что вирусы гриппа обладают способностью агглютинировать эритроциты, сыграл большую роль в развитии наших представлений об этих инфекционных частицах. Гемагглютинация оказалась крайне удобным методом для идентификации, очистки и определения .концентрации вирусов. Кроме того, с (момента обнаружения явления гемагглю-тинацип 35 лет назад
  12. Вирусы гриппа и грипп
    Э. Д. КИЛЬБУРН (Е. D. KILBOURNE) I. ВВЕДЕНИЕ. ГРИПП — ЗАБОЛЕВАНИЕ С НЕИЗМЕНЯЮЩЕЙСЯ СИМПТОМАТИКОЙ, ВЫЗЫВАЕМОЕ ИЗМЕНЯЮЩИМСЯ ВИРУСОМ Огромный интерес, привлекаемый в современной вирусологии к гриппу и вирусам, ответственным за его возникновение, требует объяснения, если учесть ординарный характер симптоматики этого, обычно очень умеренного, инфекционного заболевания дыхательных путей
Медицински портал "MedguideBook" © 2014-2019
info@medicine-guidebook.com