<< Предыдушая Следующая >>

Методы определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов

Живые зародыши не изменяются под влиянием этих красок даже спустя 2—7 ч.
Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня ре­комендуется использовать следующие краски: 1) бриллианткрезиловый синий (1:8000) — через 1 ч у мертвых яиц особенно ярко окра­шивается онкосфера, которая резко выделяется на бледном или бес­цветном фоне остального яйца; 2) сафранин: в разведении 1:8000 при воздействии в течение 2 ч и 1:5000 — в течение 3—5 ч; 3) 50 % ра­створ пирогалловой кислоты в разведении 1:2 — при воздействии в течение 1 ч при температуре 29—30 “С (чем ниже температура, тем продолжительнее процесс окрашивания).
Живые плероцеркоиды лентеца широкого очень хорошо прокраши­ваются водным раствором (1:1000) нейтральрот в течение 5—20 мин. Для получения стойкой розовой окраски, не исчезающей в течение 5 сут и не влияющей на подвижность плероцеркоидов, обычно дос­таточно 10 мин. Степень окраски контролируют путем просмотра личинок в чистом изотоническом растворе натрия хлорида, для чего плероцеркоидов периодически извлекают из краски. Целесообраз­но применять метиленовый синий для окрашивания мертвых пле­роцеркоидов.
Р.Э.Чобанов и др. (1986) предложили методику определения жиз­неспособности яиц и личинок гельминтов с использованием в каче­стве красителя пигмента «рубрин», получаемого при культивиро­вании плесневого гриба Peniciliium rubrum. Для этого используют 3 % водный раствор красителя.
Процесс окраски яиц и личинок завершается через 1,5 ч. Нежиз­неспособные яйца остриц, бычьего и карликового цепней, анкило­стомид, трихостронгилид приобретают интенсивный розовый цвет, личинки анкилостомид и трихостронгилид — красный. Менее яр­кая окраска наблюдается у яиц аскарид и власоглавов, так как, выделяясь из кишечника, они уже имеют темно-коричневый цвет: Жизнеспособные яйца и личинки не окрашиваются.
Физико-химические методы стимуляции выхода мирацвдия из яиц трематод. Методы разработаны С.М.Герман и С.А.Беэром (1984) для определения жизнеспособности яиц описторхов и дикроцелиумов путем воздействия реакционной среды на яйца. Если они живые, происходит выхождение мирацидия. Методы основаны на физико­химической активации железы вылупления мирацидия и стимуляции двигательной активности личинки. Стимуляция достигается воздей­ствием на яйца трематоды специальной реакционной среды в соче­тании с последовательными приемами — созданием перепада тем­ператур, подсушиванием взвеси яиц, воздействием слабого тока жидкости в исследуемой капле, которые способствуют массовому выходу мирацидиев из яиц.
Определение жизнеспособности яиц описторха по методу Герман, Беэра. Взвесь яиц в воде (водопроводной, отстоявшейся) предвари­тельно охлаждают до 10—12 °С. Все последующие операции осуще­ствляют при комнатной температуре (18—22 °С). В центрифужную пробирку вносят одну каплю (примерно 0,05 мл) взвеси, содержа­щей 100—400 яиц. Пробирки ставят в штатив на 5—10 мин, чтобы осадить яйца. Затем узкой полоской фильтровальной бумаги осто­рожно отсасывают излишек воды до полного ее удаления. В пробир­ку добавляют 2 капли среды, встряхивают, содержимое переносят пипеткой на предметное стекло и оставляют на 5—10 мин, слегка покачивая (или же помещают под фен) для создания слабых токов жидкости в исследуемой капле взвеси. Эта операция, имитирующая перистальтику кишечника моллюска, позволяет активизировать выход мирацидиев. После этого к взвеси добавляют еще 2 капли среды и затем препарат микроскопируют с помощью обычного све­тового микроскопа (Х200). За это время у яиц с жизнеспособным мирацидием должна открыться крышечка, при этом личинка актив­но выходит в среду. Благодаря наличию в ней этанола мирацидий через 3—5 мин обездвиживается, а затем прокрашивается красите­лем, находящимся в среде. В итоге легко обнаруживают и подсчи­тывают мирацидии.
Приготовление реакционной среды. Среду готовят на 0,05 М трис- HCi буфере в оптимальных режимах pH 8,0—9,5. В буфер добавля­ют этанол до 10—13 % и краситель (сафранин, метиленовый синий и другие, работающие в пределах pH) до слабого окрашивания жидкости (например, для сафранина его конечная концентрация составит 1:50 000). Можно использовать и другой буфер, работаю­щий в щелочных пределах pH, например 0,05 М фосфатный (pH 8,5). Следовательно, среда содержит 96 % этанол — 12 частей; краситель (маточный раствор) — 1—10 частей; 0,05 М трис-НС! буфер (pH 8,5—9,5) — до 100 частей. Пример среды: 12 частей 96 % этанола, 1 часть насыщенного раствора сафранина, остальное до 100 частей — 0,05 М трис-HCl буфер, pH 9,5.
Определение жизнеспособности яиц дикроцелиума по методу Гер­ман, Беэра, Стратана. Каплю взвеси, содержащую 100—150 яиц тре­матоды, помещают в центрифужную пробирку на 1—2 мин для осаждения яиц. Затем жидкость осторожно подсушивают с помощью полоски фильтровальной бумаги. Добавляют пастеровской пипет­кой 1—2 капли реакционной среды и инкубируют на водяной бане при 28—30 °С 2—3 мин. Состав среды: 6 частей бутанола, 94 части 0,4 % раствора хлорида натрия или 0,3 % раствора хлорида калия в дистиллированной воде. Яйца в среде переносят пипеткой на пред­метное стекло и оставляют на 1,5—2 ч при комнатной температуре (18—22 °С), при этом каждые 25—30 мин (по мере подсыхания) до­бавляют по 1—2 капли (0,05 мл) раствора бутанола в дистиллиро­ванной воде. После этого препарат микроскопируют при 100—200- кратном увеличении. Жизнеспособность определяют по числу рас­крывшихся яиц с вышедшими мирацидиями. Бутанол проникает через поры оболочки яиц, достигает мирацидиев и активизирует их. Инкубация при отмеченной температуре усиливает этот процесс. Бутанол в концентрации 3—7 % губителен для вышедшего из яйца мирацидия. Перенос взвеси яиц из пробирки на предметное стекло позволяет к моменту выхода мирацидия (через 30—40 мин) снизить концентрацию бутанола за счет улетучивания до безопасного уровня (1,5—0,5 %). Наличие в среде хлорида натрия в концентрации 0,1— 0,5 % (или хлорида калия в концентрации 0,05—0,4 %) обусловли­вает активность вышедшего мирацидия. В отличие от мелких про­зрачных яиц описторха яйца дикроцелиума имеют темноокрашенную оболочку, у них хорошо заметна крышечка, открытая после выхода мирацидия. Поэтому жизнеспособность яиц дикроцелиума удобнее оценивать путем подсчета раскрывшихся яиц, а не окраши­вания и подсчета мирацидиев.
Люминесцентный метод исследования яиц и личинок гельминтов.
Впервые в гельминтологической практике методы люминесцентной микроскопии были применены в 1955 г. При этом сообщалось, что люминесцентная микроскопия дает возможность дифференциро­вать живые и мертвые объекты без повреждения яйца. Для флюо­ресценции использовались не УФ-лучи, а сине-фиолетовая часть видимого света, с обычным микроскопом и предметными стекла­ми; к осветителю «ОИ-18» применялся специальный набор цветных фильтров.
Было установлено, что живые и мертвые яйца аскарид, остриц, карликовых цепней, бычьего цепня, широкого лентеца и других гель­минтов люминесцируют неодинаково. Это явление наблюдается как при первичной люминесценции без применения красителей, так и при окраске флюорохромами (акридиновый оранжевый, корифосфин, примулин,ауролин,сульфат берлерина, трипафлавин,риванол, акрихин и др.).
Неокрашенные живые несегментированные яйца аскарид светятся ярко-зеленым светом с желтоватым оттенком; у мертвых яиц обо­лочка излучает зеленый свет значительно ярче, чем темно-зеленая зародышевая; у яиц аскарид с личинкой проявляется только оболоч­ка, а у мертвых и оболочка, и личинка ярко-желтого цвета.
Непигментированные и несегментированные живые яйца остриц и карликовых цепней излучают зеленовато-желтый свет; у мертвых яиц интенсивно люминесцирует оболочка на фоне темно-зеленой зародышевой массы. При вторичной люминесценции (при окраске акридиновым оранжевым в разведении 1:10 ООО и 1: 50 ООО от 30 мин до 2 ч) оболочка живых и мертвых нематод, трематод и цестод люминесцирует неодинаково.
Скорлупа живых и мертвых Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum окрашивается в оранжево-красный цвет. Зародыши живых Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum и онкосферы бычьего цепня люминесцируют тусклым темно-зеленым или серо-зеленым цветом. Мертвые зародыши этих яиц гельминтов излучают «горящий» оранжево-красный свет. Живые личинки ост­риц и токсокар (освобожденные от скорлупы яйца) излучают туск­лый серо-зеленый свет, при их гибели цвет изменяется от головного конца в «горящий» светло-зеленый, затем желтый, оранжевый и, наконец, ярко-оранжевый.
При окраске флюорохромами — корифосфилом, примулином — у мертвых яиц аскарид и власоглавов наблюдается свечение от ли­лово-желтого до медно-красного цвета. Жизнеспособные яйца не люминесцируют, а окрашиваются в темно-зеленый цвет. Живые яйца трематод Paragonimus westermani и Clonorchis sinensis не люминес­цируют после окраски акридиновым оранжевым, а от мертвых яиц исходит желтовато-зеленый свет.

Метод люминесценции может быть применен и для определения жизнеспособности личинок гельминтов. Так, флюорохромированные раствором акридинового оранжевого (1:2000) личинки строн­гилят, рабдитат светятся: живые — зеленым (с оттенком), мерт­вые — ярко-оранжевым светом. Живые личинки трихинелл не светятся или дают слабое свечение при 10-минутной обработке ра­створами изотиоцианата флюоресцеина, аурамина и др. Флюорохромированные мертвые личинки (в концентрации 1:5000) дают яр­кое свечение.
Живые мирацидии, вышедшие из оболочки, излучают тусклый голубоватый свет с еле заметным светло-желтым венчиком ресни­чек, но спустя 10—15 мин после гибели проявляются ярким «горя­щим» светло-зеленым, а затем оранжево-красным светом.
Метод биологической пробы. Биологическая проба — определе­ние жизнеспособности инвазионных яиц гельминтов посредством их скармливания лабораторным животным. Это наиболее точный ме­тод. Личинками гельминта заражают соответствующего промежу­точного или окончательного хозяина, можно использовать также лабораторных животных, которым скармливают зрелые яйца или личинки паразитов. Например, для определения жизнеспособных яиц аскаридат (аскариды человека, свиней, токсокары и др.) на 1 животное (морские свинки, мыши) необходимо не менее 100—300 яиц с развившейся личинкой. Яйца аскаридат в изотоническом ра­створе натрия хлорида вводят пипеткой через рот мыши или морс­кой свинке. Через 6—7 сут животное забивают, вскрывают и иссле­дуют его печень и легкие в отдельности на наличие личинок аска­ридат. Для этого печень и легкие измельчают ножницами на мелкие кусочки и исследуют по методу Бермана (см. Гельминтологические методы исследования). Если животных заражали живыми и инвази­онными яйцами, то при вскрытии в печени и легких обнаруживают мигрирующие личинки аскаридат. Для определения жизнеспособно­сти адолескариев фасциол, собранных на растениях в биотопах ма­лого прудовика — промежуточного хозяина паразита, используют мышей, морских свинок или кроликов, которым скармливают или вводят эти личинки пипеткой через рот.
В случае заражения яйца фасциол в фекалиях лабораторных жи­вотных можно обнаружить у кроликов через 2 мес, у морских свинок через 50 сут, у мышей через 35—40 сут. Для более быстрого получе­ния ответа лабораторных животных вскрывают через 20—30 сут и исследуют печень на наличие молодых фасциол.
Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня так­же рекомендуется их скармливание не зараженным ими ранее белым мышам с последующим вскрытием животных через 92—96 ч и вы­явлением цистицеркоидов в кишечных ворсинках или цестод в про­свете кишечника.
<< Предыдушая Следующая >>
= Перейти к содержанию учебника =

Методы определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов

  1. Общая морфологическая характеристика яиц и личинок гельминтов
    Поскольку яйца и личинки большинства гельминтов выделяются через кишечник, то на практике чаще пользуются гельминтокопроскопическими методами исследований. При этом учитывают, что в пробах фекалий кроме яиц и личинок гельминтов встречаются споры грибов, крахмальные зерна, растительные клетки и волоски, ооцисты эймерий, цисты балантидий и другие структуры, иногда напоминающие яйца и личинки
  2. Частная морфологическая характеристика яиц и личинок гельминтов
    Частная морфологическая характеристика яиц и личинок гельминтов, присущих хозяевам определенных видов, приведена в подписях под иллюстрациями. МИКРОМЕТРИЯ ЯИЦ И ЛИЧИНОК ГЕЛЬМИНТОВ Микрометрия необходима для дифференциальной и более точной диагностики отдельных возбудителей, яйца и личинки которых имеют морфологическое сходство. Для микроскопических измерений служит специальный окуляр-микрометр, в
  3. Влияние факторов окружающей среды на развитие и выживаемость яиц и личинок гельминтов
    Кислород. Установлено, что для развития яиц Ascafis suilla тре­буется около 0,0009 см3 кислорода. Зрелые яйца A.suilla нуждаются в меньшем количестве кислорода, чем развивающиеся. Каждое яйцо в процессе развития требует 0,0000025—0,0000031 см3 кислорода. При прекращении доступа кислорода дальнейшее развитие яиц гель­минтов останавливается и может продолжаться при аэрации. Выживаемость яиц
  4. Методы экспериментального изучения сроков развития и выживаемости яиц гельминтов в окружающей среде
    При изучении сроков развития и выживаемости яиц гельминтов требуется проведение специальных экспериментов с искусственной закладкой проб на различных объектах окружающей среды. Опы­ты необходимо проводить, с одной стороны, в условиях, наиболее приближающихся к естественным, а с другой — при которых про­бы с яйцами гельминтов сохранялись бы в окружающей среде и их легко было бы извлекать для
  5. Культивирование личинок гельминтов
    Культивирование личинок гельминтов заключается в создании для их яиц таких условий, при которых они могли бы развиться до формирования инвазионных стадий личинок. По особенностям структуры инвазионных личинок определяют родовую, а иногда и видовую их принадлежность. Культивирование стронгилят жвачных по методу А.М. Петрова и В.Г. Гагарина состоит в том, что в бактериологические чашки или в
  6. Основные пути циркуляции яиц гельминтов в окружающей среде
    Почва. Попадание необезвреженных от яиц личинок гельмин­тов, цист кишечных простейших из нечистот (фекалий) в почву (рис. 13) происходит при отсутствии уборных, устройстве их на да­леком расстоянии от жилья и мест работы, при их антисанитарном состоянии, использовании в качестве удобрения в садах, огоро­дах, при опорожнении ночных горшков на территории дворов (у крыльца), совершении акта
  7. Черепанов А.А., Москвин А.С., Котельников Г.А., Хренов В.М.. Дифференциальная диагностика гельминтозов по морфологической структуре яиц и личинок возбудителей, 1998

  8. Биоклиматограмма как метод оценки природных предпосылок для развития и выживаемости яиц геогельминтов в почве
    Известно, что развитие и выживаемость яиц аскарид в почве обусловливаются природными факторами. Определяющими из них являются солнечная радиация, температура и влажность почвы. Для определения сроков развития яиц аскарид предложено ис­пользовать формулу Боденгеймера в следующем виде: где S — срок развития яиц аскарид (сут) при температуре Т; Т° — температура среды при проведении опыта или
  9. Пониженная жизнеспособность молодняка
    Причиной этого заболевания может быть низкое качество отобранного молодняка, что является результатом неполно­ценности инкубационных яиц. При несбалансированном кор­млении родительского стада получают яйца с недостаточным содержанием витаминов, аминокислот и других питательных веществ. Низкое качество молодняка возможно при длитель­ном хранении инкубационных яиц перед закладкой, особен­но в
  10. ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ. ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТЬ. ЖИЗНЬ. СМЕРТЬ. ОБРАТИМЫЕ И НЕОБРАТИМЫЕ ПРОЦЕССЫ
    РЕГЕНЕРАЦИЯ Однократное проявление специфической функции клетки, то есть однократное сокращение, однократное выделение секрета, - это еще не признак жизнеспособности и жизнедеятельности (13). Например, У трупа можно вызвать одиночные сокращения мышечных групп и внутренних органов, воздействуя на них электрическим разрядом, но это не значит, что ткань (орган) функционирует. Следовательно,
  11. Методы определения Rh-фактора.
    На водяной бане. b. Метод конглютинации с желатиной – агглютинация идет в коллоидной среде – самый точный, по точности равен реакции Кумбса. c. Экспресс-метод в пробирках без подогрева с 33% раствором полиглюкина. d. Определение Rh с использованием цоликлонов анти-D-супер. Метод очень удобен. 1 капля цоликлона + 1 капля эритроцитов испыт.- 2 мин = результат, но антитела моноклональные
  12. Методы определения групп крови
    При помощи стандартных сывороток. Для определения групп крови по системе АВ0 при помощи стандартных сывороток используются сыворотки I, II, III групп двух серий. Реакция проводится при комнатной температуре. Соотношение сыворотки и эритроцитов 10:1. Графологическая структура 2. Получение стандартных сывороток {foto13} {foto14} «—» - отсутствие агглютинации, «+» – агглютинация.
  13. Яйца и личинки гельминтов
    Яйца и личинки гельминтов, попав в окружающую среду, под­вергаются губительному действию ее физических и биологических факторов. Несмотря на это, значительная их часть не только сохра­няет жизнеспособность, но и развивается до инвазионной стадии и может представлять опасность как для людей, так и для животных. Развитие и выживаемость яиц гельминтов в почве. Вопросам раз­вития и выживаемости яиц
  14. Методы определения беременности у животных
    Существующие методы диагностики можно подразделить на 3 группы: клинические, лабораторные и биофизические. К клиническим относят наружные и внутренние методы. Наружными методами диагностики беременности считают рефлексологическое исследование, осмотр, пальпация, аускульта-ция. Внутреннее исследование подразделяют на вагинальный и ректальный методы. Из лабораторных методов диагностики
  15. КОСВЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КРОВЯНОГО ДАВЛЕНИЯ
    Для определения артериального давления применяются различные варианты бескровного измерения давления. С этой целью используют сфигмоманометр Рива-Роччн, или сфигмотонометр, а также в специальных методиках — осциллометр, осциллограф, механокардиограф, гемотонометр Годарта и др. В клинической практике используется классический способ определения артериального давления с помощью сфигмоманометра
Медицинский портал "MedguideBook" © 2014-2019
info@medicine-guidebook.com